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目的 探索活体转染成功的条件，把质粒pBSK5mOVA转入小鼠的皮肤组织内，并且在皮肤组织中表达。为进一步以该质粒所编码的蛋白质作为抗原诱导免疫反应，从而建立动物疾病模型奠定基础。 实验材料和方法 1．质粒DNA：质粒pBSⅡ和pBSKSmOVA。质粒pBSⅡ为含有编码大肠杆菌的β-半乳糖苷酶LacZ基因、氨苄青霉素抗性（ampr）基因的质粒载体。质粒pBSK5mOVA为含有人类K5启动子、编码OVA蛋白基因片段、人类生长因子多聚-A（poly-A）的重组质粒。 2．动物和菌株：C57BL/6和BALB/C近交系鼠。6-8周龄，体重为15-20克，雄性，均购自中国医科大学实验动物部。菌株：大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）DH5α菌株，由本实验室提供。 3．主要的试剂：TRIZOL试剂（Invitrogen公司，美国），Access RT-PCR System试剂盒（Promega公司，美国），lipofectaminTM2000试剂（Invitrogen公司，美国），兔抗鸡卵白蛋白的多克隆抗体（Life sciences公司，美国），RTPCR引物的设计根据参考文献。 4．质粒的扩增、提取及纯化：首先采用Cacl2法把大肠杆菌（Escherichia coli，E．coli）DH5α菌株制备感受态细胞（compent cells，CCs）；然后将质粒pBSⅡ和pBSK5mOVA转化人感受态细胞中，在LB（Luria-Bertani）培养板上生长繁殖，通过蓝、白菌斑筛选质粒；蓝色菌斑为含有质粒pBSⅡ的菌斑，白色菌斑为含有质粒pBSK5mOVA的菌斑。采用质粒DNA小量制备中的碱裂解法提取质粒DNA，在含有EB（50μg/ml）的0.8％琼脂糖凝胶上电泳，分析质粒DNA大小；用限制性内切酶BamH Ⅰ酶切从白色菌落中提取的质粒，在含有EB（50μg/ml）的1％的琼脂糖凝胶上电泳，分析酶切片段的大小，比较是否与预期片段大小相一致来确定是否为质粒pBSK5mOVA。 5．质粒pBSⅡ的活体转染及检测：利用含有报告基因LacZ基因的小质粒pBSn（3kb）探索阳离子脂质体介导的活体质粒DNA转染的技术及条件，实验动物为BALB/C小鼠，随机分为三组:（l）实验组:腹部拔毛后局部涂抹脂质体一质粒DNA复合体。每天两次，连续3天。（2）对照组:腹部拔毛后局部涂抹脂质体。每天两次，连续3天。（3）阴性组:仅拔毛。第4天，剪取并固定受试皮肤组织，浸在含有与UCZ基因编码产物价半乳糖昔酶发生反应且显示蓝色的5一澳4一氯一叫噪一p一D一半乳糖昔（X一卿）溶液中过夜。然后把染后的组织块制备成石蜡切片，在光学显微镜下观察是否存在蓝染细胞。 6.质粒pBSK5m0VA的活体转染及检测:在证实质粒pBSn转染成功的基础上，试图用阳离子脂质体将大质粒pBSK5mOVA（20kb）转人小鼠C57BU6和BALB/C的皮肤中。实验分为五组:（1） C57BU6鼠，拔毛后涂抹脂质体;（2）C57BL/6鼠，拔毛后涂抹裸质粒pBSK5m0VA;（3）C57BI/6鼠，拔毛后涂抹质粒pBSK5mOVA一脂质体复合体;（4）C57BU6鼠，剃毛后涂抹质粒pBSK5m0VA一脂质体复合体;（5）BALB/c鼠，拔毛后涂抹质粒pB-SKS movA一脂质体复合体。每日2次，连续3天。第4天，分别剪取受试皮肤组织，并分为两块。一块用TRIZOL试剂“一步法”提取总RNA，然后用RT一PCR试剂盒将RNA逆转录、扩增，扩增产物在含有EB（50协岁耐）的2%的琼脂糖凝胶上电泳，检测小鼠受试皮肤组织中是否有OVA特异的mRNA的表达;另一块组织被制备成冰冻切片，用抗OVA多克隆抗体，采用ABC过氧化物酶技术，AEC显色，检测小鼠受试皮肤组织是否有OVA蛋白片段的表达。结果 1.质粒的扩增、提取及纯化: 提取的质粒DNA琼脂糖电泳的结果为:DNA大小分别约为20kb和3 kb，符合两种质粒DNA的大小;BalnHI酶切从白色菌落中提取的质粒的电泳结果为:出现4个条带，DNA大小分别为12.skb、skb、Zkb、1 .3kb左右，与预期结果相一致。上述结果表明所提取的质粒分别为质粒pBSn和PBSK5mOVA。 2.质粒pBSn的活体转染实验检测结果为: 实验组小鼠的皮肤组织的毛囊结构中存在蓝染细胞，对照组和阴性组的皮肤组织切片上都未见有蓝染细胞。 3.质粒pBSK5m0VA的活体转染实验RT一PCR检测结果为: 拔毛后涂抹质粒一脂质体复合物的小鼠受试皮肤组织中均检测到目的片段:520bp的DNA产物，即皮肤组织中均有OVA特异的mRNA的表达。拔毛后仅涂抹裸质粒或脂质体及剃毛后涂抹质粒一脂质体复合物的小鼠的受试皮肤组织中均未检测到520bp的DNA片段，即皮肤组织中均未有OVA特异的mRNA的表达。 4.质粒pBSK5m0VA的活体转染实验ABC过氧化物酶法检测结果为: 每组小鼠的表皮细胞均含有深红色物质，但量明显不同。拨毛后涂抹脂质体质粒DNA复合物两组的小鼠表皮全层都红染且深红色物质较多。而拔毛后仅涂抹裸质粒组、拔毛后仅涂抹脂质体组和剃毛后涂抹质粒一脂质体复合物组的小鼠仅表皮上层红染且深红色物质较少。结论 1.在质粒pBSll的活体转染实验中，小鼠皮肤中出现了蓝染细胞。这一结果表明质粒pBSn被转染人小鼠的皮肤组织中，并且在皮肤组织的某些细胞中被转录、翻译、合成具有生命活性的物质:p一半乳糖昔酶。 2.在质粒pBS心mOVA的活体转染实验中，拔毛后涂抹脂质体一质?