乌司他丁通过调控巨噬细胞功能降低脓毒症大鼠肺毛细血管渗漏

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背景:脓毒症患者肺毛细血管渗漏(Capillary leak syndrome,CLS)发生率高,目前尚无有效防治方法,给患者健康带来极大威胁。肺毛细血管内皮结构及功能障碍是导致肺CLS发生的重要病理生理学因素。肺内皮细胞紧密连接是维持肺泡-毛细血管屏障完整性的重要结构基础。乌司他丁(ulinastatin,UTI)在临床中已显示出治疗脓毒症肺CLS的潜力,但机制尚未完全阐明。本课题组先前研究发现:UTI可以通过降低肺组织内TNF-α的表达,减少脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对脓毒症大鼠肺微细血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cell,PMVEC)紧密连接的破坏,改善肺CLS,从而减轻脓毒症肺损伤。研究表明,肺内活化的M1型巨噬细胞是肺组织中TNF-α的主要来源之一。基于以上背景,我们提出如下的科学假说:UTI可以通过调控肺组织中巨噬细胞的功能,减少肺内TNF-α,减轻其对肺毛细血管内皮细胞紧密连接蛋白的破坏,从而改善脓毒症肺毛细血管渗漏。目的:通过利用原代巨噬细胞、PMVEC及脓毒症大鼠模型,证实UTI通过调控巨噬细胞功能,保护PMVEC紧密连接,改善肺毛细血管渗漏。方法:(1)差速贴壁法制备小鼠骨髓源性巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophage,BMDM)。(2)将原代巨噬细胞分为CON(control)组、LPS组、UTI+LPS组、UTI组,通过Western blot法检测UTI对LPS处理的BMDM表型转化的影响,主要的标记物有CD86、CD206、TNF-α、TGF-β和IL-10;通过吞噬实验评估不同组别巨噬细胞的吞噬能力;通过Transwell、Scratch实验评估巨噬细胞的侵袭和迁移功能。(3)将巨噬细胞分为CON组、LPS组和UTI+LPS组,分别取各组的条件培养基与大鼠原代肺毛细血管内皮细胞(PMVEC)共培养,对应的分组为条件培养基对照(conditioned medium,CM)组、CM-LPS组和CM-UTI+LPS组,通过免疫荧光双标方法和Western blot法测定PMVEC中紧密连接蛋白Occludin、Claudin-5和ZO-1的表达情况。(4)改良盲肠结扎穿孔法(cecal ligation and perforation,CLP)建立脓毒症大鼠模型。将大鼠分为假手术组(Sham)组、CLP组、UTI+CLP组,术后48h处死动物,通过Western Blot和免疫荧光技术检测肺组织内巨噬细胞的转化情况,用伊文思蓝法、苏木精-伊红染色法评估肺毛细血管的渗漏程度,并且计算肺损伤评分和肺干湿重比。结果:(1)获得小鼠骨髓源性巨噬细胞。(2)与CON组相比,LPS组M1型巨噬细胞的标记细胞因子TNF-α,以及表型标记物CD86的表达显著增加,UTI+LPS组TNF-α和CD86的表达明显下降;相反地,LPS组M2型巨噬细胞的标记细胞因子TGF-β和IL-10,以及表型标记物CD206的表达下降,而在UTI+LPS组显著增加;LPS显著增强了巨噬细胞的吞噬能力、迁移能力和侵袭能力;UTI预处理后能抵消LPS诱导的部分吞噬能力、迁移能力和侵袭能力变化;LPS显著促进巨噬细胞单核细胞迁移蛋白(MCP-1)的表达,该蛋白的表达在UTI+LPS中显著降低。(3)在巨噬细胞条件培养基处理的PMVEC中,CM-LPS组紧密连接蛋白(ZO-1,Claudin-5,Occludin)的表达显著下降,而在CM-UTI+LPS组紧密连接蛋白的表达明显上调。(4)在动物实验中,CLP组M1型巨噬细胞的标志细胞因子TNF-α和i NOS,表型标记物CD86的表达显著增加,这些标记物在UTI+CLP组中表达显著下降;CLP组M2型巨噬细胞的标志细胞因子TGF-β,表型标记物CD206的表达显著下降,而在UTI+CLP组显著增加,免疫荧光实验中也观察到同样的趋势;CLP组肺组织中伊文思蓝含量、肺损伤评分、肺干湿重比较Sham组显著增加,而UTI预处理后显著降低了上述指标的变化。结论:(1)UTI能够抑制LPS诱导的巨噬细胞向M1型极化,促进M2型极化。(2)UTI能够抑制由LPS诱导的巨噬细胞的吞噬和迁移侵袭功能。(3)UTI可通过调控巨噬细胞的表型转化以及功能,减少脓毒症大鼠肺微血管内皮细胞紧密连接蛋白的破坏,从而缓解毛细血管渗漏,减轻脓毒症肺损伤。
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