目的:探讨通过抑制S1P或/和S2P蛋白生物活性或沉默两者基因表达,是否影响细胞内SREBP-2转运过程、自噬相关基因的表达以及细胞自噬流动态过程。方法:1.用不同浓度S1P特异性抑制剂PF-429242(1、10、30μM)或S2P特异性抑制剂Nelfinavir(NFV)(5、10、20μM)干预人肝细胞HL-7702细胞和HepG2细胞,干预不同时间(0、4、8、24 h),采用qRT-PCR和Western blot方法检测自噬相关基因和S1P、S2P、SREBP-2基因表达水平;用LC3-GFP-mRFP双标质粒转染HL-7702细胞和HepG2细胞24h后,加入PF-429242(30 μM)或NFV(20 μM)或/和自噬溶酶体抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)(50 μM)干预24h,采用Western blot方法检测LC3蛋白表达,并且在激光共聚焦显微镜下观察细胞内自噬流的变化情况。2.用S1P shRNA及S2P shRNA转染小鼠肝细胞AML-12细胞,采用qRT-PCR和Western blot方法检测自噬相关基因和S1P、S2P、SREBP-2基因表达水平。结果:1.S1P特异性抑制剂PF-429242或S2P特异性抑制剂NFV促进细胞自噬基因的表达,呈时间和剂量依赖关系。与对照组相比,S1P、S2P及SREBP-2 mRNA表达无显著统计学意义,但随着干预浓度增加、时间延长,SREBP-2前体形式P-SREBP-2蛋白表达增加,活化片段N-SREBP-2蛋白表达降低。Western blot检测显示PF-429242和CQ共同干预组或NFV和CQ共同干预组,LC3-II/LC3-I蛋白比例显著增加,激光共聚焦显微镜观察发现,与对照组相比,PF-429242或者NFV单独干预组细胞中的红色斑点显著增加,而与PF-429242或者NFV单独干预组相比,与CQ共同干预组黄色斑点明显增加,提示PF-429242或NFV都能增强细胞自噬流。2.抑制S1P、S2P基因表达后,白噬相关基因ATG5、ATG7和Beclin 1表达水平明显升高,但是SREBP-2 mRNA水平无明显变化,P-SREBP-2及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达增加,N-SREBP-2蛋白表达减低。结论:抑制S1P或S2P蛋白功能活性影响SREBP-2蛋白表达水平可以促进自噬相关基因的表达,促进细胞自噬流。抑制S1P或S2P基因的表达也可以影响SREBP-2蛋白表达水平,促进自噬相关基因的表达。目的:探讨NAFLD患者肝脏组织标本、棕榈酸诱导的脂肪变性肝细胞和高脂饮食喂养的小鼠肝脏组织中SREBP-2蛋白表达水平和自噬活性水平变化情况,以及在细胞和小鼠脂肪变模型中调节SREBP-2的细胞内转运对脂质自噬的影响及意义。方法:1.19例NAFLD患者肝脏组织和16例正常肝脏组织用于Western blot检测SREBP-2蛋白前体形式(P-SREBP-2)、入核活化片段N端(N-SREBP-2)和SCAP蛋白表达水平,以及自噬相关蛋白LC3B和溶酶体相关膜蛋白LAMP1的表达水平;肝组织石蜡包埋切片用于免疫荧光双标染色,观察LC3和LAMP1共定位情况。2.用棕榈酸(palmitic acid,PA)干预HL-7702细胞和HepG2细胞,构建脂肪变细胞模型,再用S1P特异性抑制剂PF-429242或/和S2P特异性抑制剂NFV十预细胞,采用Western blot 方法检测 P-SREBP-2、N-SREBP-2、SCAP、自噬相关蛋白 LC3、ATG5、Beclin1、LAMP1及自噬体底物蛋白死骨片蛋白(sequestosome 1,SQSTM1)的蛋白表达情况;脂肪变性肝细胞转染LC3-GFP-mRFP双标质粒,再用PF-429242或/和NFV或CQ干预,在共聚焦显微镜观察细胞内红、绿、黄色斑点;利用透射电子显微镜观察处理后的细胞内脂滴、自噬体、自噬溶酶体情况,用油红O染色观察细胞内脂滴,用100%异丙醇溶解这些结合在细胞脂滴上的油红O,用510nM吸光度定量,同时,用酶法定量细胞裂解液中的甘油三脂(triglyceride,TG)和胆固醇(total cholesterol,TC)含量。3.在高脂饲料(high-fat diet,HFD)喂养19周的C57BL/6小鼠中,通过小鼠尾静脉注射S1P、S2PshRNA包装的慢病毒,14天后处死各组小鼠。用qRT-PCR方法检测S1P和 S2PmRNA 表达水平,用 Western blot 方法检测 P-SREBP-2、N-SREBP-2、SCAP、LAMP1、SQSTM1、ATG5、Beclin1和LC3B蛋白表达水平,用免疫荧光双标染色共聚焦法检测SREBP-2和SCAP细胞内定位以及LC3和LAMP1定位及表达;利用透射电子显微镜观察各组小鼠肝脏细胞中脂滴、自噬体、自噬溶酶体情况,用油红O染色观察细胞内脂滴,同时,用酶法定量各组小鼠血清中的TG、TC、谷草转氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase,GOT)和谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transaminase,GPT)的含量。结果:1.与对照组相比,NAFLD组肝脏组织中N-SREBP-2的表达增加,且SCAP表达增多,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达增加,同时LAMP1表达降低;免疫荧光双标染色显示LC3绿色斑点数显著增加,LAMP1红色斑点数轻微降低。2.在PA干预的HL-7702细胞和HepG2细胞中,N-SREBP-2、SCAP表达增加,而P-SREBP-2表达差异无统计学意义,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达增加,ATG5、Beclin1也轻微增加,SQSTM1表达也增加,LAMP1表达降低。在PA干预的基础上,用NFV和/或PF-429242干预细胞,发现N-SREBP-2、SCAP表达降低,而P-SREBP-2增加,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、ATG5、Beclin 1及LAMP1表达都增加,同时SQSTM1表达降低;激光共聚焦显微镜观察发现HL-7702细胞和HepG2细胞在PA干预后,与CQ干预后一致,仅有绿色和黄色斑点增加,而加用NFV和/或PF-429242 干预后发现细胞中黄色斑点和红色斑点都增加,尤其是不能重合的红色斑点显著增加;透射电子显微镜观察发现在PA干预后,在大量脂滴沉积时,自噬体囊泡也形成,而加用NFV和/或PF-429242干预后,双层膜的自噬体及单层膜的自噬溶酶体都大量积累,且可以观察到正在吞噬脂滴的自噬体,细胞内脂滴减少;油红O染色结果显示大量脂滴沉积在PA干预的细胞中,油红定量检测也显示PA干预组脂滴积累明显增高,TG、TC含量也明显升高,而加NFV和/或PF-429242干预后,细胞内脂滴沉积明显减少,TG、TC含量明显降低。3.qRT-PCR结果显示沉默组S1P和S2P mRNA水平分别降低了 56%和52%。Western blot结果显示HFD阴性对照(negative control,NC)组N-SREBP-2表达增加,而沉默组N-SREBP-2表达降低,P-SREBP-2积累;共聚焦显微镜下也可观察到在NC组,细胞核内大量SREBP-2溶解蛋白积累,而沉默组细胞核内SREBP-2表达减少;相对于正常饲料(regular chow diet,CHD)喂养组,沉默组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、ATG5、Beclin 1蛋白表达增加,相对于NC组,SQSTM1蛋白表达降低,LAMP1蛋白表达增加;免疫荧光共聚焦也显示NC组表现为LC3绿色荧光斑点增加,而沉默组LAMP1红色荧光斑点明显增加;电镜也表明相对于CHD组,NC组自噬体数量增加,沉默组自噬体和自噬溶酶体数量增多,且细胞内脂滴数量减少、脂滴体积减小;油红O染色显示NC组肝细胞大量脂滴沉积,沉默组脂滴沉积显著减少。相对于NC组,沉默组血清TG、GOT及GPT含量显著降低,TC含量轻微降低。结论:1.在NAFLD患者肝脏组织、棕榈酸诱导的脂肪变性肝细胞和高脂饲料喂养的小鼠肝脏组织中,都存在SREBP-2异常活化及自噬流受损的情况。2.在PA处理的脂肪变细胞模型中,用NFV和/或PF-429242干预细胞抑制SREBP-2活化裂解,可以增强肝细胞自噬流,促进脂质自噬,降解脂质,减少脂质含量。3.在HFD小鼠模型中,S1P和S2PshRNA沉默小鼠肝脏中S1P和S2P基因表达,同样可以抑制SREBP-2活化裂解,增强肝细胞自噬流,促进脂质自噬,降解脂质,减少脂质含量。目的:探讨在体内外脂肪变模型中调节SREBP-2细胞内转运恢复细胞自噬流对内质网应激的影响及意义。方法:1.用S1P特异性抑制剂PF-429242或/和S2P特异性抑制剂NFV或自噬溶酶体抑制剂CQ干预游离脂肪酸棕榈酸PA诱导的脂肪变HL-7702细胞和HepG2细胞,采用Western blot方法检测内质网的分子标记物PERK、P-PERK、EIF2α及P-EIF2α蛋白表达情况,并用DAPI进行细胞核染色,在荧光显微镜下观察细胞核的形态学改变,并对每组凋亡的细胞进行计数。2.在高脂饲料喂养19周的C57BL/6小鼠中,通过小鼠尾静脉注射S1P和S2PshRNA包装的慢病毒,14天后处死各组小鼠。用Western blot方法检测内质网的分子标记物PERK、P-PERK、EIF2α 及 P-EIF2α 蛋白表达情况。结果:1.在体外脂肪变性细胞模型中,用NFV和/或PF-429242干预后,P-PERK,P-EIF2α蛋白表达显著降低。而在NFV和/或PF-429242干预的基础上,加CQ干预后,P-PERK和P-EIF2α蛋白表达升高。DAPI染色显示与PA干预组相比,NFV和/或PF-429242干预组凋亡的细胞核显著减少。2.与NC组相比,S1P、S2P基因沉默组P-PERK,P-eIF2α蛋白表达显著降低。结论:不论在脂肪变性细胞模型中用NFV和/或PF-429242干预,还是在高脂小鼠模型中用shRNA沉默S1P和S2P的基因表达,都可以通过调节SREBP-2细胞内转运恢复受损的细胞自噬流过程,从而缓解内质网应激,减少细胞凋亡。