本论文的研究内容属于国家重点基础研究发展计划(973计划)项目:基于“十八反”的中药配伍禁忌理论基础研究(2011CB505300)——“藻戟遂芫俱战草”配伍关系与毒效表征的基础研究(2011CB505303)课题中的一部分。本论文在课题组前期研究的基础上,以甘草-芫花反药组合为主要研究内容,分别从肠道病理损伤、肠道黏液分泌、肠道菌群以及水通道蛋白等方面研究二者配伍禁忌的生物学机制;论文同时以肠道菌群为中心点,研究了甘草与甘遂、京大戟、海藻等合用后对肠道菌群的影响。论文分为4个章节,各章节研究内容和主要结果归纳如下:一、文献研究本部分依次从中药配伍安全性研究现状、中药“十八反”现代研究进展、甘草-芫花配伍禁忌毒效表征和物质基础三个方面进行文献回顾。在中药“十八反”现代研究部分较详细地归纳了 9个方面的反药配伍禁忌的生物学机制。最后在前期研究基础上设计本论文的研究思路和实验方案。二、基于肠道和肠道菌群的甘草-芜花反药组合生物学机制(一)基于整体动物水平的甘草-芫花反药组合致肠道机械屏障损伤的研究1.甘草-芫花反药组合对小鼠肠黏膜组织的影响本节以正常小鼠为研究对象,分别从肠道病理标记物水平以及肠道组织病理切片两个方面反映肠黏膜屏障功能以及肠黏膜组织损伤情况。结果表明,芫花或甘草单用对小鼠血清二胺氧化酶水平无明显影响,但甘草-芫花合用则明显升高血清二胺氧化酶水平,表明甘草-芫花合用造成了肠黏膜组织损伤;同时相比于芫花或甘草单用组,甘草-芫花合用组磷酸脂多糖入血量显著增加,表明甘草-芫花合用损伤了肠黏膜机械屏障功能。小鼠十二指肠、回肠、结肠各肠段的病理组织切片显示,芫花或甘草单用可造成轻微的十二指肠损伤,但是对回肠和结肠基本无明显影响;但是甘草-芫花合用不仅对十二指肠有轻微损伤,且能造成回肠黏膜发生明显的炎症浸润、黏膜下层水肿以及黏膜上皮细胞缺失现象。2.甘草-芫花反药组合对小鼠肠道黏液化学表型的影响实验进一步对小鼠肠道黏液进行考察,从黏液的唾液酸修饰、硫酸化修饰情况反映黏液的稳定性及其对肠道微环境的影响。实验表明,芫花单用能够增加小鼠肠道中性黏液/酸性黏液的比例,而芫花与甘草合用后进一步增加该比例,即减少酸性黏液的比例。类似的,芫花或甘草单用能够增加小鼠肠道黏液硫酸化黏液的比例,甘草-芫花合用后进一步增加该比例,使黏液更加偏向硫酸化修饰。黏液的这些化学表型变化将使黏液层稳定性下降,酸性下降,并可能促进硫酸盐还原菌的增殖。3.甘草-芫花反药组合对黏膜上皮紧密连接、黏液分泌相关蛋白表达的影响实验从黏膜上皮紧密连接、黏液分泌相关蛋白表达的角度研究甘草-芫花合用导致肠道机械屏障受损的生物学机制。芫花或甘草单用不能明显影响小鼠回肠黏液蛋白MUC2和紧密连接蛋白ZO-1的表达,但甘草-芫花合用则显著下调小鼠回肠MUC2蛋白和ZO-1蛋白的表达,同时显著上调白介素-1β、白介素-6的表达量。同样在结肠,甘草-芫花合用能够显著下调紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达量,显著上调白介素-1β表达量。(二)基于细胞水平的甘草-芜花反药组合致肠道机械屏障损伤的研究本节实验从肠黏膜细胞存活率、迁移率以及肠黏膜细胞黏液分泌、紧密连接蛋白表达等方面探究甘草-芫花合用损伤肠道机械屏障的生物学机制,并明确具体化学成分。实验表明,甘草、芫花或甘草-芫花合用,以及芫花酯甲、甘草酸等化学成分均不能明显影响IEC-6细胞的生长和迁移,说明肠黏膜组织损伤是由药物本身之外的因素导致的。进一步研究表明芫花素、芹菜素、甘草酸及其单葡萄糖醛酸代谢产物能够剂量依赖性降低LS174T细胞MUC2蛋白的表达,芫花酯甲能够剂量依赖性升高该细胞MUC2蛋白表达,而甘草酸能够削弱芫花酯甲上调MUC2蛋白表达的作用。甘草酸、芫花素等成分还能同时下调MUC2基因转录,甘草酸、甘草次酸、芫花酯甲等成分能够上调黏液硫酸化修饰相关基因转录。在IEC-6细胞中,芫花素、芹菜素、芫花酯甲以及甘草酸单葡萄糖醛酸代谢产物、甘草次酸均能剂量依赖性下调ZO-1蛋白的表达。可见,芫花和甘草中的主要化学成分均能同时下调肠黏膜细胞黏液分泌和紧密连接相关蛋白的表达,二者合用将导致药效的叠加,从而引起甘草-芫花合用对肠黏膜机械屏障的损伤。(三)基于细胞代谢组学和蛋白质组学的甘草-芜花反药组合调节肠道屏障功能的分子机制研究本节实验主要以肠黏膜细胞LS174T为研究对象,并选取芫花中的芫花素和甘草中的甘草酸为代表性成分,研究芫花素、甘草酸以及二者合用对LS174T细胞代谢轮廓和蛋白质组的影响,从而分析芫花素-甘草酸合用可能在哪些方面影响肠道屏障功能。实验表明,芫花素和甘草酸均能影响LS174T细胞的甘油磷脂代谢、氨基酸代谢和核苷代谢功能,二者合用后则主要影响甘油磷脂代谢通路,说明二者在甘油磷脂代谢通路方面产生叠加作用。甘油磷脂代谢通路异常将对细胞膜及其膜受体的功能产生干扰。蛋白质组学实验表明,芫花素和甘草酸造成的上调或下调差异蛋白中,各有将近一半的差异蛋白为二者共有,说明芫花素和甘草酸的调节作用存在很大程度的重叠。在代谢通路方面,芫花素和甘草酸显著调节的20条通路中,有8条通路为二者共有,且在合用组这些通路调节作用得到加强。芫花素-甘草酸合用能够影响包括病毒感染、致病菌感染、紧密连接、细胞损伤等方面的生物学过程,这些过程与肠道屏障功能密切相关。(四)甘草-芫花反药组合对肠道菌群结构及其宏基因组的影响本节实验应用16SrDNA测序的方法研究甘草-芫花反药组合的配伍禁忌特征,通过比较甘草、芫花或甘草-芫花反药组合对正常小鼠肠道菌群的调节作用进一步挖掘合用增毒相关信息。结果表明相较于芫花或甘草单用,甘草-芫花合用能够更加明显地引起小鼠肠道菌群群落结构的变化。芫花或甘草单用分别引起3个和2个菌属丰度发生变化,而甘草-芫花合用能够引起13个菌属丰度变化,且能够引起条件性致病菌脱硫弧菌属丰度提高近10倍,相关性分析表明脱硫弧菌属相关菌群丰度也发生了显著变化。宏基因组预测分析表明,甘草、芫花和甘草-芫花反药组合共引起肠道菌群2306个代谢基因发生变化,对应着341条代谢通路中的化学反应。在芫花或甘草引起的前20条差异化学反应中,均出现硫化氢代谢相关基因,且在甘草-芫花合用组中这10个基因的丰度均得到进一步提高。同时,通过检测小鼠粪便和血清中的硫化氢水平发现,甘草-芫花反药组合能够显著提高小鼠粪便硫化氢含量,并显著降低小鼠血清硫化氢浓度,说明甘草-芫花反药组合打破了小鼠肠道硫化氢代谢平衡。三、甘草与甘遂、大戟、海藻等反药组合对肠道菌群的影响本章内容在甘草-芫花反药组合研究的启发下,从肠道菌群的角度探索“藻戟遂芫俱战草”中其它反药组合的配伍禁忌特征。并且进一步利用肠道菌群预测大戟类药材千金子与甘草之间是否也存在配伍禁忌。结果表明甘草-甘遂反药组合对肠黏膜组织不能造成明显的损伤,且与甘遂或甘草单用相比甘草-甘遂合用也不能进一步破坏肠黏膜屏障功能。但是,肠道菌群研究显示,甘草-甘遂反药组合能够造成肠道菌群群落结构发生显著的变化,使脱硫弧菌属细菌的丰度上升10倍,使极低丰度的寄生型支原体属细菌上升至15.5%的丰度,成为丰度最高的菌属。同时,合用组中肠道菌群宏基因组中碳固定通路、能量代谢通路、醌类合成通路相关基因均被下调,而磷酸转移酶系统、戊糖磷酸途径、甘油酯代谢和脂代谢通路相关基因均被上调。这些基因调节均与支原体属细菌的变化相吻合。进一步研究表明,甘草-甘遂反药组合破坏了肠道菌群脂代谢平衡和硫化氢代谢平衡,使粪便中胆固醇含量和硫化氢含量均显著增加。这些结果表明甘草-甘遂反药组合破坏了肠道菌群群落结构及其相关代谢平衡,可能会对机体健康产生威胁。甘草-京大戟反药组合、甘草-海藻反药组合均能够显著改变小鼠肠道菌群群落结构,扰乱菌群的代谢。其中甘草-京大戟组合能够增加产生氨气和硫化氢的细菌丰度,并增加支原体属等寄生型细菌的丰度,增加肠道菌群孢子形成相关代谢、脂类代谢等功能,削弱肠道菌群三羧酸循环等能量代谢功能。甘草-海藻组合同样能够增加支原体属细菌丰度,扰乱肠道菌群果糖代谢、脂肪酸代谢以及含硒化合物代谢等功能。千金子中的二萜醇酯类化合物大戟因子L1与甘草合用同样能够扰乱小鼠肠道菌群结构,提高苯丙氨酸和色氨酸代谢、亮氨酸代谢、甲烷代谢、糖鞘脂合成、鞘脂代谢、分支酸代谢等氨基酸代谢和能量代谢功能,降低蛋白质修复功能和碳水化合物降解功能,使肠道菌群较多地分解芳香氨基酸产生吲哚等有害代谢产物,同时碳水化合物降解功能降低不利于短链脂肪酸等物质的产生,不利于维护肠道菌群群落结构的稳定。四、基于水通道蛋白(AQPs)的甘草-芫花反药组合生物学机制(一)甘草-芜花反药组合利尿作用评价采用腹腔水负荷小鼠模型分别表征芫花单用、甘草单用以及甘草-芫花合用对小鼠尿量的影响,并对影响尿液生成的关键因素进行考察。结果表明在药典高限剂量范围内,芫花单用能够表现出明显的利尿作用,甘草对小鼠尿量无明显影响,但是当芫花与甘草合用后芫花的利尿作用明显降低。在此过程中,无论是甘草、芫花或甘草-芜花合用对肾小球滤过率均无明显影响。芫花在发挥利尿作用的同时能够显著降低尿液浓缩倍速,稀释尿液,而甘草或甘草-芫花合用均无此作用。进一步研究表明,芫花单用对尿液中主要电解质Na+、K+、Cl-离子的重吸收均无显著影响,而甘草或甘草-芫花合用能够导致K+离子流失。甘草、芫花或二者合用对血清抗利尿激素、醛固酮水平均无显著影响。综合以上数据,结合文献表明芫花可能通过影响肾小管水分的重吸收发挥利尿作用,而肾脏水通道蛋白AQPs可能是其中的关键靶点。(二)甘草-芫花反药组合对肾脏AQPs蛋白表达的影响在腹腔水负荷小鼠模型基础上,采用WesternBlot法分别研究甘草、芫花或甘草-芫花组合对肾脏AQPs表达的影响。在肾脏主要的AQPs亚型AQP1、AQP2、AQP3、AQP4中,芫花单用能够显著下调小鼠肾小管AQP2蛋白表达,甘草单用能够显著上调AQP2蛋白表达,而甘草-芫花合用对AQP2蛋白表达量无显著影响。甘草、芫花或甘草-芫花组合对AQP1、AQP3、AQP4蛋白表达均无显著影响,同时对三种AQP2主要的磷酸化形式、对AQP2上游蛋白精氨酸加压素受体AVPV2R蛋白表达均无显著影响。这表明甘草-芫花反药组合可能通过直接上调或下调肾小管AQP2蛋白表达量造成合用“降效”的现象。进一步研究表明芫花中的芫花酯甲、芫花素等成分能够剂量依赖性下调肾小管细胞AQP2蛋白表达,而甘草中的入血成分甘草次酸能够剂量依赖性上调肾小管细胞AQP2蛋白表达,且甘草次酸能够减弱芫花酯甲或芫花素的调节作用。动物实验进一步证明,芫花酯甲和芫花素具有一定程度的利尿作用,均能一定程度上下调小鼠肾脏AQP2蛋白表达,且芫花酯甲和芫花素的利尿作用以及下调AQP2的作用均受到甘草酸的干扰而减弱。(三)基于网络药理学和分子对接研究AQP2蛋白调节机制本节研究通过网络药理学和分子对接方法研究芫花酯甲、芫花素以及甘草次酸调节AQP2的分子机制。通过PharmMapper数据库筛选以及信号通路构建,结果表明,芫花素、芫花酯甲和甘草次酸共匹配出30个蛋白靶点和49条信号通路。在甘草次酸相关的11个靶点中,9个靶点同时与芫花酯甲和芫花素关联。在所有靶点和信号通路中,MEK1和FGFR1蛋白及其对应的ERK信号通路同时与芫花酯甲、芫花素以及甘草酸相关,且文献报道该通路参与了 AQP2的调节过程。后续利用AutoDock Vina分子对接软件进一步证明芫花酯甲、芫花素和甘草酸能够选择性地结合到MEK1蛋白和FGFR1蛋白的活性位点,且结合能均高于各靶点自带的天然配基。后续细胞实验进一步证明芫花酯甲、芫花素、甘草酸均能通过调节肾小管细胞p-ERK和p-CREB水平(ERK通路关键靶点)改变AQP2的表达量,且甘草酸能够减弱芫花酯甲或芫花素的调节作用。