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第一部分RNA干扰沉默EZH2在人卵巢癌顺铂耐药株的高表达目的检测EZH2基因在人卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP及其亲本细胞株A2780中的表达差异,通过RNA干扰稳定沉默EZH2在A2780/DDP细胞株中的表达。方法1.实时荧光定量PCR和免疫印记法检测EZH2的mRNA和蛋白水平在A2780/DDP及A2780细胞中的表达差异。2.人工合成4条特异性干扰EZH2的shRNA片段,定向克隆插入Supersilencing shRNA质粒表达载体pGPU6/GFP/Neo,获得4种EZH2 shRNA表达载体。3.脂质体法将上述4条质粒瞬时转染至A2780/DDP细胞,实时荧光定量PCR检测EZH2的沉默水平以挑选沉默效果最佳的质粒。进一步G418加压筛选得到稳定细胞株,实时荧光定量PCR和免疫印记法检测稳定转染细胞系EZH2的表达。结果1.A2780/DDP细胞EZH2 mRNA和蛋白的表达分别是A2780细胞表达量的(3.50±1.06)、(2.10±0.29)倍,P<0.01,差异均有统计学意义。2.4种EZH2 shRNA的表达载体构建成功,实时荧光定量PCR结果表明shEZH2-1583重组质粒沉默效果最佳。3.将shEZH2-1583重组质粒稳定转染至A2780/DDP细胞,EZH2的mRNA及蛋白水平分别下降(83.66±5.65)%和(77.57±3.90)%,P<0.001,差异均有统计学意义。结论EZH2基因在A2780/DDP细胞中的表达明显升高,EZH2 shRNA表达载体构建成功,获得EZH2基因稳定沉默的A2780/DDP细胞系。第二部分EZH2基因沉默逆转卵巢癌细胞株顺铂耐药的实验研究目的研究EZH2基因沉默对卵巢癌顺铂耐药细胞系A2780/DDP耐药性的影响及其可能机制。方法将pGPU6/GFP/Neo-EZH2shRNA:表达载体稳定转染至A2780/DDP细胞株获得稳定转染细胞系,MTT法检测细胞对顺铂的耐药性,免疫印记法检测H3-(me)3-K27的表达,流式细胞术检测细胞凋亡。结果shEZH2重组质粒稳定转染A2780/DDP细胞后,细胞对顺铂的IC50下降(61.33±11.40)% (P<0.05),H3-(me)3-K27的蛋白水平下降(50.50±7.80)% (P<0.001),差异均有统计学意义。转染后细胞凋亡率无明显变化,P>0.05,差异无统计学意义。结论EZH2基因沉默能有效逆转A2780/DDP细胞对顺铂的耐药性,EZH2可能通过介导H3K27甲基化在卵巢癌铂类耐药中发挥重要作用。第三部分EZH2基因沉默抑制卵巢癌耐药细胞增殖迁移的实验研究目的研究EZH2基因沉默对卵巢癌耐药细胞株增殖及迁移能力的影响。方法脂质体转染法获得EZH2沉默的A2780/DDP细胞株后,MTT法检测细胞增殖,流式细胞学检测细胞周期,Transwell小室实验检测细胞迁移。结果shEZH2重组质粒稳定转染A2780/DDP细胞后,细胞增殖能力明显下降(P<0.05),G2/M期细胞增加(P<0.01),体外迁移能力下降(P<0.01),差异均有统计学意义。结论EZH2基因沉默能抑制卵巢癌顺铂耐药细胞增殖能力,使细胞发生G2/M期阻滞,并降低细胞的迁移能力,为卵巢癌耐药的表观遗传学治疗提供新靶点。第四部分EZH2基因沉默体内治疗卵巢癌顺铂耐药的研究目的在体水平研究EZH2基因沉默对卵巢癌顺铂耐药的影响。方法选取4周龄、雌性BALB/C-nu裸小鼠24支,随机分为两组,分别将shEZH2稳定转染细胞和shVector稳定转染细胞打入裸鼠皮下,建立两组卵巢癌耐药裸鼠移植瘤模型。当肿瘤平均直径达0.5cm,每组再随机再随机分为顺铂处理组(腹腔注射顺铂溶液)和未处理组。每日测量肿瘤的大小,称量裸鼠体重。两组模型顺铂对肿瘤的抑制率=(V未处理组-V顺铂处理组)/V未处理组。免疫组化检测瘤体的EZH2和H3-(me)3-K27的蛋白表达,HE染色检测肝肾组织的形态学结构,。结果1.顺铂腹腔注射后,顺铂处理后1、3、5、7天,shEZH2组顺铂抑瘤率分别为39%,59%,71%,80%；而shVector组顺铂抑瘤率分别为12%,29%,43%,43%,各时间点shEZH2组顺铂的抑瘤率较shVector组明显增高,P<0.05,差异均有统计学意义。两组模型顺铂处理组和未处理组体重无明显差异,P>0.05。各组裸鼠肝肾组织结构正常。2.成瘤后5周,shEZH2未处理组裸鼠肿瘤体积较shVector未处理组明显减小,P<0.05,差异有统计学意义。3.免疫组化示shEZH2组移植瘤组织中EZH2和H3-(me)3-K27染色强度较shVector组减弱,表达下调,P<0.05,差异有统计学意义。结论EZH2基因沉默在体水平亦能有效逆转卵巢癌耐药裸鼠移植瘤模型对顺铂的耐药性、抑制肿瘤生长,EZH2基因治疗逆转卵巢癌顺铂耐药安全有效。