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目的 乙型肝炎病毒(HBV)常导致慢性感染，易发展为重型肝炎。目前认为，HBV本身对肝细胞元直接致病作用，而被HBV感染的淋巴细胞通过细胞凋亡机制来清除病毒，这种现象被称为HBV所致的T细胞活化诱导的细胞死亡(activation induced cell death，AICD)，其所致的免疫损伤可能是乙型肝炎重要的发病机制之一。细胞免疫功能减弱，可能是导致HBV持续慢性感染的一个重要因素，是形成HBV慢性感染免疫耐受的一个重要机制。凋亡是为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序性的死亡。引起凋亡的核心成分是一类蛋白水解酶，统称为天冬氨酸蛋白酶(cysteine-requiring aspartate protease，caspase)家族，该家族蛋白酶能特异的在底物的N-末端识别天冬氨酸酶解位点，并进行酶解。caspase-3是该家族的成员，是在凋亡途径下游操作底物酶解的关键蛋白酶，caspase-3被激活后，将会引起细胞凋亡，被称为凋亡的执行者。 慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)包括人体主要的免疫细胞，与人体的免疫状态密切相关。现已有研究证明PBMCs是HBV肝外感染的主要场所。通过对PBMCs的研究，了解慢性乙型肝炎患者细胞免疫功能的状况、PBMCs凋亡的情况及凋亡因子caspase-3表达的状况，进一步探讨慢性乙型肝炎患者PBMCs凋亡的发生及其与caspase-3的关系，为深入研究乙型肝炎慢性化发病机制提供了一定的实验依据。 材料与方法 HBV携带者及慢性乙型肝炎患者共35例，男22例，女13例，年龄在18岁～64岁，平均38岁。根据临床指标及症状分为五组，无症状HBsAg携带者(chronic asymptomatic HBsAg carrier，ASC)10例，慢性乙型肝炎轻度组10例，慢性乙型肝炎中度组8例，慢性乙型肝炎重度组7例，所有病例诊断均符合2000年中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订“病毒性肝炎防治方案”的诊断标准。乙型肝炎标志物HBsAg及抗一HB-el步均阳性，排除HAv、HCv、HDv和HEv感染，排除近3个月应用糖皮质激素、干扰素等影响免疫功能药物的患者。健康对照10例，男5例，女5例，年龄在18岁一32岁，平均年龄26岁，取自健康献血员。 一、PBMcs的提取与培养: 无菌抽取肝素抗凝静脉血6血，应用密度梯度离心法分离PBMcs，加人PHA，用含小牛血清的即Ml一1640培养72h后，收集细胞，一80℃冻存。 二、细胞凋亡的检测: 1.原位末端脱氧核昔酸转移酶标记法(terr滋n滋deoxyribonucleoti勿1廿ansferase一mediated biotinylated dU皿，niek一end labeling，TUNEL): 取培养细胞涂片后，用4%多聚甲醛固定后，按细胞凋亡检测试剂盒说明书进行。细胞核呈黄褐色染色的为阳性细胞。 2.流式细胞术(flow eytome坷，FCM): 培养的细胞用70%乙醇固定，一30℃过夜。离心去掉固定液，并用冷PBS洗2次，加人含有助aseA的PI染液约500醉。室温静置30分钟后上流式细胞仪。 三、caspase一3的检测: RT一PCR方法: 1.RNA的提取:应用TRIZOL提取PBMCs RNA，逆转录合成cDNA，然后进行PCR反应检测PBMCs中easpase一3的表达。 2.引物设计序列如下: easpase一3一F:5‘一AGG ACT CAAA竹CTG TTG CCA CC一3‘(sense);easpase一3一R:5’一TGG AACAAATG(;ACC TGT TGA CC一3’(anti一sense)。产物理论值:365bp(序列与GenebankA印52647进行比较核对)。 内参照序列:p一aetin一F:5’名TG GGG CGC CCC AGG CAC CA一3‘;p一ac-血一R:5’一CTI’ CCT TAA TGT CAC GCAC以叨TC一‘。产物理论值:540bp。 3.RT一PCR过程: 逆转录:37℃30分钟。PCR扩增:94℃灭活逆转录酶5分钟后;94℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸l分钟，进行35个循环;72℃终末延伸5分钟。 4 .PCR产物电泳检测:将扩增的PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，用天能GIS凝胶图像处理系统(上海天能科技有限公司)分析检测每个扩增带的产物含量，用相应的PCR分析软件对caspase一含量进行半定量分析。用下列公式表示:casPase一的相对含量二easpase一密度/p一actin密度x100%。结果 一、PBMcs培养鉴定: 分离的PBMCs加PHA培养72h后，培养液色变黄，无混浊，细胞数明显增多，用台盼蓝染液检查细胞活性:计数200个细胞，计算活细胞百分率，活性在95%以上。 二、TUNEL检测分析:见图1，表1 HBV携带者及慢性乙型肝炎患者PBMCs加人PHA刺激培养后凋亡明显增加，慢性乙型肝炎轻度组的凋亡率(9.13%*0.85%)明显升高，与健康组及慢性乙型肝炎重度组凋亡率(0.58%土 0.42%、0.95%土0.79%)比较p<0.05。慢性乙型肝炎中度组及HBV携带组凋亡率较健康组及慢性乙型肝炎重度亦升高，但比较无统计学差异。 三、FCM检测分析:见图ZA、ZB及表2 FCM检测发现，慢性乙型肝炎患者PBMCs凋亡明显增加，慢性乙型肝炎轻度组的凋亡率(0.56士0.60)明显升高，与健康组及慢性乙型肝炎重度组(0.42土0.27、0.42士0.23)比较p<0.05。慢性乙型肝炎中度组凋亡率亦增高，但无统计学意义。