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目的龋病是人类最常见的口腔疾病，世界卫生组织将其列为人类重点防治的疾病之一；变形链球菌(Streptococcus mutans，S．mutans)是人类最主要的致龋菌之一；白屈菜红碱(Chelerythrine，CHE)是从中草药白屈菜中提取的主要活性成份，但作用机制尚不太清楚。本文通过体外实验研究CHE对S．mutans的生长、粘附以及代谢的影响，旨在探讨其防龋作用机制，为今后开发出一种新型防龋制剂提供前期实验依据。材料与方法1．CHE溶液和菌液制备：采用二倍稀释法将CHE对倍稀释于脑心浸萃液琼脂培养基(Brain Heart Infusion，BHI)中，配成100mg／ml至24.4μg／ml共计13个浓度的溶液。将复苏48h的菌种接种于BHI液体培养基中，厌氧条件下培养24h，然后离心，洗菌两次，用无菌生理盐水调光密度值(Optical Density，OD)为1.0的菌悬液，备用。2．CHE溶液抑制S．mutans生长的检测采用纸片扩散法测定不同浓度CHE溶液对S．mutans的抑菌圈大小，以1.6mg／ml的氯已啶作为阳性对照；采用试管稀释法测定CHE对S．mutans生长的最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)大小。3．CHE溶液对S．mutans产酸作用的影响采用酸度计将已配制好的CHE溶液和对照组调定初始pH值为7.4，向低于MIC以下的CHE溶液中接种S．mutans菌液，厌氧条件下分别培养3～48h，测定不同培养时间间隔上清液的pH值，并计算培养前后的(?)pH。4．CHE溶液对S．mutans疏水性的影响取24.4μg／ml、48.8μg／ml、97.7μg／ml、195.3μg／ml、390.6μg／ml、781.3μg／ml 6个浓度组的CHE溶液，采用微生物粘着碳氢化合物法(Microbial adhesion to hydrocarbons，MATH)测定S．mutans细胞表面疏水性，计算细菌表面疏水率。5．CHE溶液对S．mutans粘附作用的影响取MIC以下的浓度，用BHI液体培养基配制48.8μg／ml、97.7μg／ml、195.3μg／ml、390.6μg／ml四个浓度组的CHE溶液。向0.05ml各浓度的CHE溶液分别加入已调定光密度为1.0的菌液0.1ml，BHI液体培养基2.1ml和50％蔗糖-0.5mol／l磷酸缓冲液0.25ml，于玻璃试管中以与水平面呈30°的角度在厌氧条件下培养18h。然后将粘附到试管壁的细胞洗脱于蒸馏水中，测定540nm处的光密度值，并计算粘附抑制率。6．葡萄糖基转移酶(Glucosyltransferase，GTF)的提取和细胞外水不溶性多糖(Water insoluble glucan，WIG)的检测用含2％蔗糖的BHI液体培养基配制不同浓度的CHE溶液各3ml，加入S．mutans菌液0.3ml，厌氧培养24h，将细菌培养物离心，收集上清液，以上试管各两份，一份加入固体硫酸铵，使达60％饱和度，置于4℃冰箱过夜后离心，将沉淀溶于磷酸盐缓冲液中透析48h，获得GTF。采用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定酶液总蛋白含量，采用蒽酮法测定酶-底物反应液中还原糖量，GTF活性(IU)定义为标准条件下(37℃反应1h)每min从蔗糖释放1μmol还原糖所需的酶量，并计算GTF比活力大小。另一份加入0.5M NaOH洗涤、离心3次，合并上清液，加入3倍体积无水乙醇，4℃冰箱过夜后离心，将沉淀加入0.1M NaOH溶液5ml溶解，采用蒽酮法测定细胞外WIG的含量。7．统计学分析采用SPSS13.0统计软件，各组总体均数之间比较采用单因素方差分析(Analysis of variance，ANOVA)；采用Student-Newman-Keuls检验进行各样本组间均数的两两比较；相关分析采用Spearman检验方法。P＜0.05为统计学上有显著性差异，P＜0.01为统计学上有高度显著性差异。结果1．在纸片扩散法抑制S．mutans实验中，6.25mg／ml至100 mg／ml的5组CHE溶液产生了抑菌圈，100 mg／ml CHE溶液产生的抑菌圈最大，为25.8mm。浓度与抑菌圈直径之间呈正相关关系，经Pearson相关分析，r=0.99，P＜0.01。经液体稀释法实验测定，CHE溶液对S．mutans的MIC为0.78 mg／ml。2．随着CHE溶液浓度逐渐降低，实验前后各溶液(?)pH值则呈逐渐增高的趋势，经统计学检验，24.4μg／ml浓度组与对照组之间及390.6μg／ml与195.3μg／ml浓度组之间的(?)pH值无显著性差异(P＞0.05)，其余各浓度组(?)pH之间均有高度显著性差异。随着培养时间间隔的延长，实验前后各溶液(?)pH值则呈逐渐增高的趋势。3h间隔条件下，各浓度组与对照组(?)pH之间无显著性差异(P＞0.05)，其余各时间间隔组间均有高度显著性差异(P＜0.01)。CHE溶液浓度越高则达到最大产酸抑制作用所需的时间越长。48.8μg／ml和97.7μg／ml CHE溶液与对照组的(?)pH分别在6h和12h间隔的差异最大，而195.3μg／ml和390.6μg／ml浓度组与对照组的(?)pH在24h间隔的差异最大。3．随着CHE溶液浓度的逐渐升高，疏水率呈逐渐降低的趋势，经统计学检验，各浓度实验组与对照组之间均有高度显著性差异(P＜0.01)，24.4μg／ml、48.8μg／ml、97.7μg／ml和195.3μg／ml四个浓度组间则均无统计学差异(P＞0.05)。4．随着CHE溶液浓度的逐渐升高，粘附抑制率也随之增高，经统计学检验，195.3μg／ml和390.6μg／ml与对照组之间及与其余浓度组之间均有高度显著性差异(P＜0.01)；48.8μg／ml浓度组及97.7μg／ml浓度组与对照组之间则均无显著性差异(P＞0.05)。5．随着CHE溶液浓度的逐渐升高，S．mutans的GTF逐渐降低，各实验组与对照组均数之间均有高度显著性差异(P＜0.01)，但24.4μg／ml与48.8μg／ml两个浓度组之间，97.7μg／ml、195.3μg／ml、390.6μg／ml三个浓度组之间无显著性差异(P＞0.05)。随着CHE溶液浓度的逐渐升高，各浓度组S．mutans产生的WIG逐渐降低，除了24.4μg／ml浓度组之外，各实验组与对照组均有高度显著性差异(P＜0.01)，195.3μg／ml与390.6μg／ml之间无显著性差异(P＞0.05)。结论1．CHE对S．mutans的生长具有明显的抑制作用，可显著降低S．mutans的产酸作用；2．CHE可以降低S．mutans细胞表面疏水性，并显著抑制S．mutans在玻璃表面的粘附作用；3．CHE对S．mutans菌液中葡萄基转移酶具有一定抑制作用，降低了S．mutans细胞外WIG的合成；4．在龋病防治领域，作为天然植物白屈菜的一种提取物，CHE具有一定应用前景。