靶向EV--D68 VP1蛋白DE loop的单克隆抗体的制备及其中和效应分析

来源 :北京协和医学院中国医学科学院 北京协和医学院 中国医学科学院 清华大学医学部 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zwsbjh
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肠道病毒(EV)D68型最初分离并鉴定于1962年,并因2014年的美国爆发流行而引起重视。由EV-D68引起的呼吸道疾病在欧洲、泰国、中国、新西兰和一些非洲国家陆续被报道。2018年,WHO优先预防感染疾病蓝皮书中首次述及EV-D68病毒及其感染,该病毒可引起诸如肺炎等严重的下呼吸道疾病,也有报道称其可引起中枢神经系统症状,比如急性迟缓性麻痹(Acute Flaccid Paralysis,AFP)。鉴于目前有效的治疗药物及预防性疫苗依然处于探索阶段,基于感染的动物模型开展单克隆抗体分选和鉴定的研究有望成为EV-D68病毒预防与治疗领域新的突破口。  本论文通过单个B细胞分离技术获得了一株具有中和效应的EV-D68单克隆抗体A6-1,并揭示了该抗体发挥中和效应的作用机制。以滴鼻形式对恒河猴进行EV-D68昆明分离株的感染后,利用制备的EV-D68VPl重组蛋白作为分选抗原从感染动物体内分离获得了病毒特异性单个记忆性B细胞,并通过巢式PCR技术扩增记忆B细胞中的抗体轻重链基因,最终配对获得31个抗体基因。经过特异性、结合力、亲和力强弱和中和活性验证,确认了E2-2、F4-3、D7-4和A6-1具有中和EV-D68的抗病毒活性。随后,以中和活性最高的A6-1作为模式抗体,进行抗体结合抗原特征、结合位点扫描及中和作用模式的研究。结果显示,A6-1能够识别EV-D68病毒结构蛋白VP1的DE loop区域,且该区域的R126、I131、I133是A6-1结合病毒的关键氨基酸。同时,通过病毒、抗体、唾液酸两两之间的共定位分析表明,A6-1具备干扰病毒与细胞表面a2,6-唾液酸相互作用的活性。由此,推测A6-1与EV-D68病毒“canyon”区域结合后产生一定的空间位阻作用,进而阻碍了EV-D68病毒“canyon”区域与宿主细胞的a2,6-唾液酸结合,最终发挥中和效力,抑制病毒对宿主细胞的吸附。A6-1对乳鼠的攻毒保护性实验中,A6-1能够有效抑制EV-D68鼻腔攻毒导致的乳鼠感染。  为进一步完善EV-D68病原学、尤其是病毒传播等理论研究,探索其疫苗和单克隆抗体评价的潜在动物模型,本论文通过对血常规、病毒排毒情况、病毒血症特征及病理学分析等指标检测和验证,对EV-D68雪貂感染模型进行了综合研究。结果表明,EV-D68能够在雪貂体内增殖,特别是在下呼吸道的肺组织中增殖并导致肺部感染,引起肺损伤及炎性相关的病理学反应。因此,雪貂是一种可以较好模拟EV-D68下呼吸道感染的动物模型。  综上所述,本文利用单个B细胞分离技术获得了EV-D68特异性单克隆抗体,定位了抗体发挥中和效应的作用靶点,并揭示了抗体阻止病毒感染宿主细胞的可能机制。同时建立的EV-D68的雪貂感染模型为EV-D68的病原学研究、疫苗药物评价奠定基础。
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