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蛋白核小球藻是一种具有光合作用能力的微生物,也是一种可食性微藻。在基因工程食品开发中,与其他微生物宿主相比,利用小球藻作为宿主表达蛋白,具有独特的优点:无须宿主食用安全性评价;较真菌、病毒来说,无毒素残留;较高等植物而言,生产效率高。在转基因方法中,叶绿体基因重组相比于核基因组重组具有基因拷贝数多、表达可靠、没有基因沉默现象等优点。然而,当前蛋白核小球藻的叶绿体基因转化系统的研究较缺乏,蛋白核小球藻的叶绿体基因组尚未完成全序列测序,通过蛋白核小球藻叶绿体基因重组技术的转基因工程尚有较多困难。本研究室前期曾经以其他植物和微藻的基因信息为基础,设计叶绿体基因同源重组载体,开展过叶绿体基因转化研究。本文为了使叶绿体转基因操作更加有效,拟先对蛋白核小球藻叶绿体基因组序列进行测序,在密码子偏好性分析的基础上,重新构建基因转化的质粒载体,建立新的蛋白核小球藻叶绿体基因转化系统。本文以蛋白核小球藻FACHB-5藻株为研究对象,先提取总DNA,然后进行叶绿体基因组测序,根据得到的基因序列,对小球藻叶绿体进行密码子偏好性分析。以鱼类神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白和人神经生长因子(h NGF)β亚基作为目标蛋白,结合叶绿体基因组序列信息和密码子偏好性信息,构建相应的叶绿体表达载体P-423-RMCP和P-cp-agβNGF,通过电穿孔法将载体P-423-RMCP转入蛋白核小球藻中,通过PCR鉴定转化结果。本文的主要研究结果如下:(1)蛋白核小球藻FACHB-5叶绿体基因组测序结果已经递交Gene Bank,登录号为MN128434;(2)蛋白核小球藻叶绿体基因密码子偏好性较强,获得最优密码子16个(TTC、TTA、ATC、GTA、TCT、CCA、ACT、GCT、TAC、CAA、AAC、GAC、GAG、TGT、CGT、GGT);(3)人工合成赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)主衣壳蛋白基因DNA分子,重构建质粒P-423-RMCP;合成质粒P-423-RMCP,经PCR和酶切鉴定,质粒合成正确;(4)根据测得的叶绿体基因组序列,优化了同源臂长度,根据蛋白核小球藻的密码子偏好性,优化了人神经生长因子β亚基的基因序列,设计构建了人神经生长因子β亚基的叶绿体表达载体P-cp-agβNGF;(5)用电穿孔法将质粒P-423-RMCP转入藻细胞,通过抗性筛选获得阳性藻,经PCR鉴定,证明质粒成功转入小球藻细胞中。NNV是鱼类养殖生产中重要病原之一,本研究构建表达NNV衣壳蛋白的叶绿体表达载体,对于鱼类疫病防治、食品生产安全提供了基础研究。h NGF是一种神经细胞生长调节因子,是重要的生物药物,通过小球藻转基因表达h NGFβ可以为重要药物的开发提供研究基础。