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第一部分草酸钙激活肾小管上皮细胞NADPH氧化酶介导的氧化应激对成石相关蛋白表达的作用研究【目的】探究NADPH氧化酶及细胞氧化应激在草酸钙诱导的肾小管上皮细胞成石相关蛋白表达中的作用及机制【方法】采用草酸钙晶体处理NRK-52E细胞,流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)含量(DCFH-DA探针),检测细胞SOD、CAT、MDA含量及培养上清8-OHd G含量,共聚焦显微镜观察细胞内Ca2+信号强度,real-time PCR检测细胞AT1R表达,western blot检测细胞AT1R、NAPDH氧化酶亚基(nox2和nox4)、NF-κB通路亚基(p50和p65)和成石相关蛋白(OPN、CD44和MCP-1)表达;同时,采用NADPH氧化酶抑制剂apocynin处理细胞,观察其对上述指标的变化影响。采用腹腔注射乙醛酸法构建高草酸尿肾结石大鼠模型,Elisa法检测大鼠血清Ang Ⅱ浓度,western blot及免疫组化染色检测大鼠肾脏组织内AT1R表达。【结果】草酸钙处理诱导NRK-52E细胞内ROS产生增加,细胞SOD和CAT活性降低,而MDA及8-OHd G含量升高。western blot检测显示,细胞NADPH氧化酶亚基(nox和nox4)、NF-κB亚基(p50和p65)和成石相关蛋白(OPN、CD44和MCP-1)表达均明显升高;apocynin可降低细胞ROS水平,抑制NADPH氧化酶亚基(nox和nox4)、NF-κB亚基(p50和p65)和成石相关蛋白(OPN、CD44和MCP-1)表达。此外,草酸钙可诱导NRK-52E细胞内Ca2+浓度升高,real-time PCR及western blot检测显示AT1R表达增加,高草酸尿大鼠血清Ang Ⅱ浓度升高,western blot及免疫组化检测显示大鼠肾脏组织内AT1R表达增加。【结论】草酸钙激活NADPH氧化酶介导的肾小管上皮细胞氧化应激及ROS过量产生,进一步促进NF-κB亚基(p50和p65)和成石相关蛋白(OPN、CD44和MCP-1)表达增加。同时,草酸钙刺激细胞内Ca2+浓度升高和Ang Ⅱ/AT1R表达增加,可能参与细胞氧化应激过程。第二部分Ang Ⅱ/AT1R介导的内质网钙释放在肾小管上皮细胞氧化应激及肾结石形成中的作用及机制【目的】探究Ang Ⅱ/AT1R及内质网钙释放在肾小管上皮细胞氧化应激及肾结石形成中的作用及机制【方法】采用草酸钙晶体处理NRK-52E细胞,Elisa法检测细胞内IP3含量,western blot检测细胞IP3R(IP3R1、IP3R2和IP3R3)表达;采用IP3R抑制剂2-APB抑制内质网钙释放,共聚焦显微镜观察细胞内Ca2+信号强度,流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)含量(DCFH-DA探针),western blot检测细胞NAPDH氧化酶亚基(nox2和nox4)、NF-κB通路亚基(p50和p65)和成石相关蛋白(OPN、CD44和MCP-1)表达;采用si RNA或losartan抑制AT1R表达,观察其对细胞内Ca2+浓度、氧化应激水平、NF-κB通路亚基(p50和p65)和成石相关蛋白(OPN、CD44和MCP-1)表达的影响。采用腹腔注射乙醛酸法构建高草酸尿肾结石大鼠模型及losartan治疗模型,western blot检测细胞NAPDH氧化酶亚基(nox2和nox4)、NF-κB通路亚基(p50和p65)和成石相关蛋白(OPN、CD44和MCP-1)表达,免疫组化染色检测成石相关蛋白(OPN、CD44和MCP-1)表达,Von Kossa染色检测大鼠肾脏内草酸钙晶体形成情况。【结果】草酸钙处理NRK-52E后细胞IP3及部分IP3R(IP3R1和IP3R2)表达明显升高。2-APB可抑制细胞内Ca2+浓度升高,同时细胞内ROS产生、NAPDH氧化酶亚基(nox2和nox4)、NF-κB通路亚基(p50和p65)和成石相关蛋白(OPN、CD44和MCP-1)表达均被不同程度抑制。AT1R-si RNA或losartan可抑制细胞内质网钙释放及ROS产生,降低NAPDH氧化酶亚基(nox2和nox4)、NF-κB通路亚基(p50和p65)和成石相关蛋白(OPN、CD44和MCP-1)表达。Losartan处理抑制高草酸尿肾结石大鼠肾脏NAPDH氧化酶亚基(nox2和nox4)、NF-κB通路亚基(p50和p65)和成石相关蛋白(OPN、CD44和MCP-1)表达,且大鼠肾脏内草酸钙晶体形成也明显减少。【结论】草酸钙诱导肾小管上皮细胞Ang Ⅱ/AT1R活化,通过IP3/IP3R介导的内质网钙释放进一步激活NADPH氧化酶及细胞氧化应激,增加NF-κB通路活性及成石相关蛋白的表达,促进草酸钙晶体的黏附及肾结石的形成。