日本血吸虫病至今仍是一种严重危害公众健康的公共卫生问题，几十年来我国采取以化疗为主的综合防治措施，药物、围垦灭螺受江湖洲滩环境的限制、大规模反复化疗带来的巨大开支及血吸虫抗吡喹酮耐药株的出现给血吸虫病防治带来了新的挑战。同时由于日本血吸虫有多种保虫宿主，完全阻断其传播途径比较困难，因此人用日本血吸虫抗病疫苗的研制和应用是必要的。 迄今，很多国内外实验室已克隆和表达了一系列日本血吸虫抗原基因，获得了数种疫苗候选分子。然而，基因重组技术只适用于蛋白和多肽类抗原，但在筛选到的有效抗原分子中，＞200、38和17KD等抗原是含有保护性糖类决定簇的糖蛋白，这些糖类决定簇可以用抗独特型抗体的方法来制备。在国家“七五”攻关计划中，管晓虹教授等采用感染日本血吸虫尾蚴一年半的BALB／c小鼠脾细胞与SP2／O细胞融合，用多克隆抗GAA和抗SEA免疫血清筛选，建立了一株日本血吸虫单克隆抗独特型抗体，命名为NP30，经实验证明为日本血吸虫肠相关抗原GAA的内影象anti-id。NP30主动免疫C57BL／6对尾蚴攻击感染产生42.05％的保护力，肝组织减卵率为66.63％；BALB／c和昆明种小鼠的保护率分别为39.53％和50.46％；免疫山羊可诱导42.78％的减虫率，肝组织减卵率为35.83％，粪减卵率为25％，并可明显抑制肝脏虫卵肉芽肿的大小，肉芽肿数量明显减少，纤维化减轻，体重明显增加，因此Np30是 南京医科大学博士学位论文 很有希望的抗日本血吸虫病疫苗侯选分子。 由于NP30由鼠杂交瘤制备，应用于人体会产生人杭鼠抗体， 随着分子生物学的发展，对鼠源性抗体改造成为可能。本文克隆了 NP30可变区基因，研究其诱导保护效果，同时分析设计了 NP30 抗原模拟位点基因并进行初步鉴定。 本研究主要内客概括如下： 一、日触吸虫单克隆杭独特型抗体NP30轻链可变区基因（V） 及重链可变区基因（仰的体外扩增、克隆和序列分析 为了得到日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30轻链、重链可 变区（W、V）基固序列，我们根据小鼠免疫球蛋白轻链和重链 可变区基因中FRI和FM序列的保守性特征片段，以及已经发表 的小鼠VL和VH基因片段，设计并化学合成了若干套分别针对于 不同亚类ig骨架区序列FRI和FM的通用引物，用于体外扩增日 本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30轻链和重链可变区基因。为了 便于克隆和表达，在引物两端引进了合适的酶切位点（轻链和重链 引物的5’和3’端分别带有Xbal、spel、Thol和EcoRI酶切位点 以利于亚克隆）。分别以日本血吸虫单克隆抗独特型抗体Wb o的 杂交瘤细胞株总基因组DNA和其提取RNA进行RTICR合成的 CDNA第一链为模板，扩增V。、V。基固，扩增产物鉴定后，将其 克隆A pUC19载体，重组子用 San驴r’s双脱氧链终止法和自动测 序法测定其序列，序列与 Gene Bank中及已发表的抗体序列进行比 较分析。结果：V。基困全长 31 sbp，属鼠免疫球蛋白。轻链第 IV 亚类，由种系基固 V与人。重排而来，编码 109个氨基酸残基。该 VL基因序歹。】已被 Gene B毗收录（accession No AF206720）。V。基因 全长 357hp，属鼠免疫球蛋白重链第I亚类，由种系基因 V、DSpZ．8 与JH4重排而来，编码119个氨基酸残基。该VH基因序列已被怔lie Bud收录（aCCeSSIOnNOAF282776）。证明该V。和V。基因为日本 血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30轻链和重链可变区基固。两个基 ．2－ 南京医科大学博士学位论文 困均为分泌日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30的杂交瘤细胞株 所产生的有功能的抗体可变区片段。 二、日本血吸虫单克隆杭独特型抗体NP30的单链狐（ScF）的 构建、表达及对BALBIC小鼠诱导保护性作用研究 l、日本血吸虫单克隆杭独特型抗体NP 0的单链抗体归CFV）的构建、 表达 通过 PCR方法体外扩增并经测序验证的重链、轻链可变区 （VH、VL）基因先后重组入原核表达质粒pTHA90相应的位点上， 中间通过一连接肽（Gly在er）。基因连接构建成单链抗体基因 ＊CFv），连接产物转化相应受体菌 TOP，提取质粒，酶切、扩 增和测序鉴定出重组克隆。重组克隆经酶切鉴定可见预期大小的片 段，表明重组成功。表达产物经 ELISA和 western blot检测证实具 有与相应抗原结合的能力。本研究成功地构建了。Fv基因，且其 表达产物保留了抗体的亲和性和特异性，有可能替代杂交瘤细胞分 泌的单克隆抗体NP30作为免疫检测试剂。 2、日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30的单链抗体kCFV）对 BALB／C小鼠诱导保护性作用研究 为了研究日本血?