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目的:建立氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,Ox-LDL）诱导人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）损伤模型,观察Ox-LDL对血管内皮细胞功能的影响,探讨来源于内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,e NOS）第四内含子中的27碱基重复序列转录的27nt-miRNA对Ox-LDL诱导HUVECs损伤的影响及其分子调控机制,为27nt-miRNA应用于动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）疾病的治疗提供理论及实践依据。方法:1.HUVECs的体外培养及27nt-miRNA慢病毒载体转染以27nt-miRNA序列:5’-GAAGTCTAGACCTGCTGCAGGGGTGAG-3’为依据,设计、合成、构建27nt-miRNA高表达、anti-27nt-miRNA及阴性对照慢病毒载体,分别转染HUVECs后,采用荧光显微镜观察细胞绿色荧光表达情况,流式细胞术检测慢病毒转染效率,q RT-PCR法检测27nt-miRNA的表达量。2.27nt-miRNA对Ox-LDL诱导损伤的HUVECs凋亡、增殖、迁移及血管形成的影响用含10μg/m L、20μg/m L、40μg/m L、80μg/m L、160μg/m L的Ox-LDL处理HUVECs 48 h,采用流式细胞术和MTT法检测细胞的凋亡率和增殖能力,确定Ox-LDL诱导HUVECs损伤的浓度。将HUVECs分为:正常对照组、Ox-LDL组、27nt-miRNA+Ox-LDL组、anti-27nt-miRNA+Ox-LDL组和miRNA-NC+Ox-LDL组。正常对照组给予正常培养;Ox-LDL组用40μg/m L Ox-LDL作用48 h诱导细胞损伤;27nt-miRNA+Ox-LDL组、anti-27nt-miRNA+Ox-LDL组和miRNA-NC+Ox-LDL组分别以相同的操作方法转染相应慢病毒后用40μg/m L Ox-LDL作用48 h诱导细胞损伤。采用MTT法检测细胞增殖能力;细胞划痕实验和Transwell检测细胞迁移能力;Hoechst 33258染色法和流式细胞术检测细胞凋亡率;人工基底胶检测细胞管腔形成能力;q RT-PCR和Western blot检测27nt-miRNA、e NOS、VEGF、Caspase-3、Bax和Bcl-2 m RNA和/或蛋白表达水平;硝酸还原法检测NO的产量。3.27nt-miRNA通过PI3K/Akt通路调节氧化低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞损伤将HUVECs分为:Ox-LDL组、anti-27nt-miRNA+Ox-LDL组、LY294002+Ox-LDL组和LY294002+anti-27nt-miRNA+Ox-LDL组。Ox-LDL组和anti-27nt-miRNA+Ox-LDL组用40μg/m L Ox-LDL作用48 h诱导细胞损伤;LY294002+Ox-LDL组和LY294002+anti-27nt-miRNA+Ox-LDL组先用含0.45μg/m L PI3K/Akt抑制剂LY294002预处理0.5 h,再用40μg/m L Ox-LDL处理48 h诱导细胞损伤。采用MTT法检测细胞增殖能力;细胞划痕实验和Transwell检测细胞迁移能力;Hoechst 33258染色法和流式细胞术检测细胞凋亡率;人工基底胶检测细胞管腔形成能力;q RT-PCR法检测27nt-miRNA表达情况;Western blot检测p-Akt、e NOS、VEGF、Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达水平;硝酸还原法检测NO的产量。结果:1.荧光显微镜下可见细胞表达绿色荧光,流式细胞术结果表明三种慢病毒转染效率均达90%以上。此外,q RT-PCR结果表明,与正常对照组比较,27nt-miRNA组HUVECs内27nt-miRNA的表达量增加（P＜0.05）,anti-27nt-miRNA组HUVECs内27nt-miRNA的表达量降低（P＜0.05）,慢病毒成功转染HUVECs,细胞株构建成功。2.本实验最终以40μg/m L Ox-LDL刺激HUVECs 48 h作为细胞损伤模型进行后续实验。与正常对照组相比,Ox-LDL组27nt-miRNA的表达上调（P＜0.05）,细胞活力与迁移能力降低（均P＜0.05）,细胞凋亡率升高（P＜0.05）,管腔形成能力降低（P＜0.05）。27nt-miRNA高表达可使细胞活力与迁移能力显著降低（均P＜0.05）,细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）,管腔形成能力显著降低（P＜0.05）,e NOS、VEGF和Bcl-2 m RNA与蛋白表达量降低（均P＜0.05）,Bax和Caspase-3 m RNA与蛋白表达量升高（均P＜0.05）,NO的产量减少（P＜0.05）;而抑制27nt-miRNA表达时,细胞活力与迁移能力升高（均P＜0.05）,细胞凋亡率降低（P＜0.05）,管腔形成能力升高（P＜0.05）,e NOS、VEGF和Bcl-2 m RNA与蛋白表达量升高（均P＜0.05）,Bax和Caspase-3 m RNA与蛋白表达量降低（均P＜0.05）,NO的产量增加（P＜0.05）。3.Ox-LDL可抑制p-Akt的表达（P＜0.05）,27nt-miRNA表达升高可使p-Akt的表达量降低（P＜0.05）,而抑制27nt-miRNA表达时,p-Akt的表达量升高（P＜0.05）。PI3K/Akt抑制剂LY294002处理HUVECs后,27nt-miRNA的表达升高（P＜0.05）,细胞活力与迁移能力显著降低（均P＜0.05）,细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）,管腔形成能力显著降低（P＜0.05）,p-Akt、e NOS、VEGF和Bcl-2的蛋白表达水平显著下调（均P＜0.05）,Bax和Caspase-3的蛋白表达水平显著上调（均P＜0.05）,NO的产量显著减少（P＜0.05）。结论:1.27nt-miRNA促进Ox-LDL诱导的HUVECs凋亡,抑制细胞增殖、迁移与血管形成。2.27nt-miRNA通过负调节PI3K/Akt信号通路,促进Ox-LDL诱导的HUVECs凋亡,抑制细胞增殖、迁移与血管形成。