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灵芝酸是灵芝产的一种有30个碳原子的四环三萜类化合物,研究表明灵芝酸具有抗HIV和抗肿瘤等多种药理学活性。灵芝酸具有两种不同的化学结构。其中,Ⅰ型灵芝酸的羊毛甾醇骨架上只有一个单双键结构,而Ⅱ型灵芝酸的羊毛甾醇骨架上含有两个共轭双键。目前,菌丝体液体培养灵芝细胞是一种可以有效生产灵芝酸的方法。由于液体培养灵芝细胞生产的灵芝酸产量较低,限制了灵芝酸的商业化生产和临床应用,因此进一步提高灵芝中灵芝酸的产量具有重要意义。本文中,我们将整合发酵策略和基因工程改造应用到了提高灵芝菌丝体发酵生产单体灵芝酸中。我们研究了在液体静置培养灵芝细胞中整合表达透明颤菌血红蛋白(VHb)和钙离子添加策略下灵芝酸的生物合成情况。结果显示,整合策略下五种单体灵芝酸GA-O,-Mk,-T,-S和-Me的最大产量分别为1451.33±67.50,179.66±5.06,1320.59±20.84,1431.23±79.74和1283.81±85.13?g/100 mg细胞干重,这些产量分别为静置培养条件下野生型菌株(对照)中各单体灵芝酸含量的2.66,2.50,2.52,3.50和5.98倍。整合策略下单体灵芝酸GA-O,S和Me最大产量比目前报道的最高产量分别有16.67%,22.54%和40.88%的提高。表明,整合VHb表达和钙离子添加策略可以更有效地提高单体灵芝酸的生产。为了研究整合策略下灵芝酸高产的原因,我们分析了不同培养条件下灵芝酸生物合成过程中的中间代谢产物鲨烯和羊毛甾醇的积累量以及灵芝酸合成的四个关键酶—3-羟基-3-甲基戊二酰-乙酰辅酶A还原酶(HMGR),法尼基焦磷酸合成酶(FPS),鲨烯合成酶(SQS)以及细胞色素P450氧化酶CYP-5150L8基因的表达情况。结果显示,整合策略下中间代谢产物的积累量和灵芝酸生物合成基因的转录水平均显著高于对照条件下的结果。鲨烯和羊毛甾醇的最大积累量出现在第9天,分别为1.50±0.28?g/g和106.55±2.74?g/g细胞干重,其积累量分别为对照中积累量的2.0和1.42倍。整合策略下hmgr,fps,sqs和cyp-5150l8最高转录水平出现在第9天,分别上调了2.56,3.31,2.59和6.12倍。以上结果表明,整合策略下灵芝酸的高产可能与中间代谢产物积累量的提高以及生物合成基因表达水平的上调有关。前期研究发现环境因素会影响液体培养灵芝中灵芝酸的分布,然而基因工程改造对灵芝酸分布的影响仍未报道。因此,我们分析了液体静置培养灵芝中VHb表达对Ⅰ型与Ⅱ型灵芝酸分布的影响。在第12天和第15天,VHb灵芝工程菌株中Ⅰ型与Ⅱ型灵芝酸的比例分别为0.422和0.432,与液体静置培养WT菌株中的结果相比分别提高了12.53%和20.67%。结果表明,液体静置培养条件下VHb的表达提高了Ⅰ型与Ⅱ型灵芝酸的比例。Ⅰ型与Ⅱ型灵芝酸比例的提高可能是由于参与灵芝酸氧化合成过程中的氧化酶的活性在VHb表达后被上调。研究发现细胞色素P450氧化酶CYP512 A2,CYP512 V2和CYP512 A13可能参与了灵芝酸生物合成过程中羊毛甾醇骨架氧化修饰,因此我们分析了静置培养条件下VHb的表达对a2,v2和a13转录水平的影响。结果显示VHb的表达使得a2,v2和a13的转录水平分别提高了2.28,2.65和3.54倍。此结果暗示Ⅰ型与Ⅱ型灵芝酸的比例的提高可能与a2,v2和a13的转录水平上调有关。这些P450氧化酶在调控灵芝酸多样性方面的具体作用机制值得进一步研究。我们的结果表明在液体静置培养灵芝细胞中整合表达透明颤菌血红蛋白(VHb)基因表达和钙离子添加策略是一种可以更有效地提高单体灵芝酸积累的方法。并且,灵芝细胞在液体静置培养条件下VHb的表达提高了Ⅰ型与Ⅱ型灵芝酸的比例。本工作对于大规模发酵生产灵芝酸和深入了解灵芝酸多样性调控机制具有重要意义。