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第一章hMLHl基因的甲基化在骨肉瘤细胞株阿霉素耐药中的作用研究目的探讨hMLHl基因的启动子甲基化与骨肉瘤耐阿霉素细胞株MG63/ADR的阿霉素耐药是否相关；探讨去甲基化药物5-氮-2’-脱氧胞苷对MG63/ADR细胞的hMLHl基因启动子的甲基化状态、hMLHl基因的表达以及阿霉素耐受性的是否有影响。方法甲基化特异性PCR法对骨肉瘤阿霉素耐药细胞株MG63/ADR及其亲本株MG63细胞的hMLHl基因启动子的甲基化状态的检测；MTT法及流式细胞术检测MG63/ADR细胞对阿霉素的耐药指数、5-氮-2’-脱氧胞苷对MG63/ADR细胞的毒性作用以及MG63/ADR细胞经不同浓度的5-氮-2’-脱氧胞苷干预48h后其对阿霉素的半数抑制浓度及耐药逆转指数；甲基化特异性PCR法、实时荧光定量PCR法及Western blot法测定5-氮-2’-脱氧胞苷对MG63/ADR细胞hMLHl基因启动子的甲基化状态、mRNA及蛋白的表达影响。结果MG63细胞的hMLHl基因的启动子为非甲基化MG63/ADR细胞的hMLHl基因的启动子为部分甲基化；MG63和MG63/ADR细胞对阿霉素的半数抑制浓度分别为2.28±0.12μM和11.18±0.11μM, MG63/ADR的耐药指数为4.90,确定为骨肉瘤的阿霉素耐药株；5-氮-2’-脱氧胞苷干预48h,50μM5-氮-2’-脱氧胞苷为MG63/ADR细胞的无毒剂量,100μM5-氮-2’-脱氧胞苷为其低毒剂量；MG63/ADR细胞被无毒剂量及低毒剂量5-氮-2’-脱氧胞苷处理后,阿霉素对MG63/ADR细胞的半数抑制浓度分别降至6.18±0.13μM和4.42±0.12μM；耐药逆转指数分别为1.81、2.53；无毒剂量和低毒剂量5-氮-2’-脱氧胞苷都能相当好地去除hMLHl基因启动子的甲基化,hMLHl mRNA及其蛋白的表达增高。结论骨肉瘤MG63/ADR细胞为hMLHl基因启动子部分甲基化的细胞株,MG63为hMLHl基因启动子非甲基化的细胞株。hMLHl基因启动子的甲基化可能参与了骨肉瘤MG63/ADR细胞的阿霉素耐药。无毒剂量和低毒剂量5-氮-2-脱氧胞苷能相当好的去除hMLHl基因启动子的甲基化且对细胞无增殖抑制,使hMLHl基因的mRNA和蛋白的表达上调,从而部分逆转骨肉瘤MG63/ADR细胞对阿霉素的耐药。图13幅,表8个,参考文献41篇。第二章骨肉瘤组织中hMLHl基因甲基化状态及其蛋白表达与骨肉瘤临床病理及预后的关系目的检测新诊断的骨肉瘤组织中hMLHl基因的甲基化状态,探讨骨肉瘤组织中hMLHl基因的甲基化与骨肉瘤患者的临床病理和预后之间的关系。方法酚/氯仿法提取50例骨肉瘤患者的福尔马林固定石蜡包埋骨肉瘤组织的DNA；巢式甲基化特异性PCR法检测hMLHl基因的甲基化状态；χ2检验分析hMLHl基因的甲基化状态与患者临床病理资料的关系；hMLHl基因的甲基化与患者的总体生存、无瘤生存采用单因素分析Kaplan-Meier法,并对生存曲线进行对数秩和(Log-rank)检验。hMLHl基因的甲基化与其蛋白表达的相关性采用Spearman等级相关分析。结果50例骨肉瘤组织样本中巢式MSP扩增成功的有46例,其中发生了hMLHl基因甲基化的有20例,占44.48%。hMLHl基因的甲基化与患者不同年龄段、性别、病理类型、Enneking分期、分级等均无关,只与5年无瘤生存相关。总体生存的单因素分析,hMLHl基因甲基化组与非甲基化组患者的总体生存曲线分离,非甲基化组较甲基化组的生存时间长,但尚无统计学意义。结论hMLHl基因启动子的甲基化是骨肉瘤发生中的普遍事件,与骨肉瘤患者的无瘤生存相关,与患者的总体生存无关；有望成为预测骨肉瘤患者术后复发的分子标志及个体化化疗的生物靶点。hMLHl基因启动子甲基化是其功能失活的重要机制,与其蛋白的表达呈负相关。图7幅,表2个,参考文献14篇。