研究背景与目的哮喘是一种由多种炎性细胞参与的慢性气道变应性炎症性疾病，其机制尚未完全阐明。Th2细胞的过度活化分泌IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子是哮喘发生和发展的关键。过去一直用“Th1/Th2失衡学说”来解释哮喘的发病机制，但随着对哮喘发病机制研究的深入，目前认为机体对过敏原免疫耐受的缺陷才是造成Th1/Th2失衡的根本原因，机体调节性T细胞（Regulatory T cells, Treg细胞）数量不足和功能的缺陷是哮喘患者免疫耐受缺陷的关键。因此，在体内诱导并扩增Treg细胞的策略，有助于维持机体对过敏原的免疫耐受。1,25-二羟维生素D3(1α,25-Dihydroxyvitamin D3,1,25（OH）2D3是有生物活性的维生素D形式，调节骨盐和钙盐/磷酸盐代谢。除此之外，1,25（OH）2D3还具有免疫调节作用。树突状细胞是维生素D作用的主要靶细胞。1,25（OH）2D3对树突状细胞的作用主要体现在抑制DC的分化及成熟，下调共刺激分子CD40、CD80和CD86的表达，减少IL-12分泌、促进IL-10分泌，使DC获得耐受特性，诱导Treg细胞产生。这种免疫调节效应不仅仅局限于体外，动物实验研究结果表明，1,25（OH）2D3对Th1介导的自身免疫性疾病有保护作用，但对Th2介导的哮喘的保护作用尚有争议，多数研究显示1,25（OH）2D3对哮喘有保护作用，但机制尚未完全阐明。疱疹病毒侵入介质（herpesvirus entry mediator,HVEM）也称TNFRSF14，是肿瘤坏死因子受体家族成员，广泛地表达于T细胞、DC等细胞上。早期研究发现HVEM对T细胞分化有重要调节作用。HVEM既可以作为共刺激分子以HVEM-LIGHT方式促进T细胞增殖，也能作为抑制性分子以HVEM-BTLA/CD160方式抑制T细胞增殖。但HVEM在DC介导T细胞分化中的作用尚未完全清楚。研究表明，HVEM-/-的小鼠不仅不表现出免疫抑制，反而更容易发生自身免疫性疾病。HVEM-/-小鼠的抗原呈递细胞刺激CD4+T细胞增殖的能力较野生型小鼠增强。HVEM过表达的DC促进IL-10分泌，抑制CD4+T细胞增殖，诱导产IL-10的CD4+T细胞，同时HVEM过表达的DC免疫过继治疗对小鼠实验性自身免疫性心肌炎有保护作用。这些研究初步表明，HVEM作为抑制性分子可能参与了DC介导的免疫耐受及Treg细胞产生。因此，我们假设1,25（OH）2D3处理的DC通过上调抑制性分子HVEM的表达，下调共刺激分子CD80、CD86和CD40表达，分泌IL-10，促进Treg细胞分化、扩增，抑制效应性T细胞分化、增殖。本课题在以往工作的基础上，用哮喘模型中常用的变应原OVA及致炎物质LPS刺激1,25（OH）2D3处理的小鼠骨髓来源树突状细胞（bonemarrow-derived dendritic cells,BMDC）观察其对1,25-二羟维生素D3处理的树突状细胞表型及功能的影响。在此基础上初步探讨HVEM在1,25-二羟维生素D3处理的树突状细胞诱导Treg细胞分化中的作用。研究方法第二章：OVA及LPS刺激对1,25（OH）2D3处理的树突状细胞表型及功能的影响1. OVA及LPS刺激对1,25（OH）2D3处理的树突状细胞表型的影响1.1参照Inaba等人的小鼠BMDC培养方法，稍加改进，获得5-6天的不成熟DC（imDC）。在不成熟DC培养的第3天加入10^-8mol/L1,25（OH）2D3培养至第8天收获，获得1,25（OH）2D3处理的DC （D3/imDC）。不成熟DC培养的第7天加入1ug/ml的LPS或100ug/ml的OVA刺激24小时促进成熟，获得成熟DC。在1,25（OH）2D3处理的DC培养的第7天加入1ug/ml的LPS或100ug/ml的OVA刺激24小时，获得OVA及LPS刺激1,25（OH）2D3处理的DC （OVA-D3/imDC及LPS-D3/imDC）。1.2通过与不成熟DC、1,25（OH）2D3处理的DC、成熟DC形态的比较观察OVA及LPS刺激1,25（OH）2D3处理的DC的形态变化。1.3OVA及LPS刺激对1,25（OH）2D3处理的树突状细胞吞噬功能的影响获得OVA及LPS刺激1,25（OH）2D3处理的DC、不成熟DC、1,25（OH）2D3处理的DC及成熟DC与FITC-OVA孵育后，流式细胞术检测FITC-OVA表达强弱，判断其吞噬功能。1.4OVA及LPS刺激对1,25（OH）2D3处理的DC表面共刺激分子CD80、CD86、CD40及MHCⅡ表达的影响收集OVA及LPS刺激1,25（OH）2D3处理的DC、不成熟DC、1,25（OH）2D3处理的DC及成熟DC，流式细胞术检测CD80、CD86、CD40及MHCⅡ表达，判断DC成熟程度。2. OVA及LPS刺激对1,25（OH）2D3处理的树突状细胞功能的影响2.1收集OVA及LPS刺激1,25（OH）2D3处理的DC、不成熟DC、1,25（OH）2D3处理的DC及成熟DC培养上清，ELISA检测细胞因子IL-12p70、IL-6、IL-10。2.2混合淋巴细胞反应方法检测1,25（OH）2D3处理的DC对OVA及LPS驱动的CD4+T细胞增殖的影响2.3OVA及LPS刺激对1,25（OH）2D3处理的DC诱导Treg细胞分化的影响OVA及LPS刺激1,25（OH）2D3处理的DC与CD4+CD25-T细胞共培养96h，收集细胞，流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+表达。2.4FACS检测OVA及LPS刺激对1,25（OH）2D3处理的DC表面CCR5、CCR7及CXCR4表达的影响。收获OVA及LPS刺激1,25（OH）2D3处理的DC、不成熟DC、1,25（OH）2D3处理的DC及成熟DC，流式细胞术检测CCR5、CCR7及CXCR4表达。第三章： HVEM对1,25（OH）2D3处理的DC诱导Treg细胞分化的影响1. ELISA方法检测OVA及LPS刺激对1,25（OH）2D3处理的DC分泌IL-2的影响。收获OVA及LPS刺激1,25（OH）2D3处理的DC、不成熟DC、1,25（OH）2D3处理的DC及成熟DC培养上清，ELISA检测细胞因子IL-2水平。2.1,25（OH）2D3处理的DC表面抑制性分子HVEM、PDL1、PDL2表达2.1收获OVA及LPS刺激1,25（OH）2D3处理的DC、不成熟DC、1,25（OH）2D3处理的DC及成熟DC，流式细胞术检测HVEM、PDL1、PDL2表达。2.2收获OVA及LPS刺激1,25（OH）2D3处理的DC、不成熟DC、1,25（OH）2D3处理的DC及成熟DC，Real-time RT-PCR方法检测HVEM mRNA相对表达。3. HVEM对1,25（OH）2D3处理的DC诱导Treg细胞分化的影响3.1HVEM对OVA刺激1,25（OH）2D3处理的DC诱导Treg细胞分化的影响收获第8天OVA刺激1,25（OH）2D3处理的DC，加入抗HVEM单克隆抗体（10ug/ml）或同型单克隆抗体（10ug/ml）阻断48小时，与CD4+CD25-T细胞共培养96h，收获培养上清及细胞。ELISA检测培养上清IL-10及IL-4水平，Real-time RT-PCR检测Foxp3mRNA及GATA-3mRNA相对表达。3.2HVEM对LPS刺激1,25（OH）2D3处理的DC诱导Treg细胞分化的影响收获第8天LPS刺激1,25（OH）2D3处理的DC，加入抗HVEM单克隆抗体（10ug/ml）或同型单克隆抗体（10ug/ml）阻断48小时，与CD4+CD25-T细胞共培养96h，收获培养上清及细胞。ELISA检测培养上清IL-10及INF-γ水平，Real-time RT-PCR方法检测Foxp3mRNA及T-bet mRNA表达。4. HVEM对1,25（OH）2D3处理的DC抑制OVA及LPS驱动的CD4+T淋巴细胞增殖的影响收获第8天OVA及LPS刺激1,25（OH）2D3处理的DC，加入抗HVEM单克隆抗体（10μg/ml）或同型单克隆抗体（10μg/ml）阻断48小时，洗去未结合抗体，再与CD4+CD25-T细胞共培养96h，观察对CD4+T淋巴细胞增殖的影响研究结果第二章：OVA及LPS刺激对1,25（OH）2D3处理的DC表型及功能的影响1. OVA及LPS刺激对1,25（OH）2D3处理的DC表型的影响1.1OVA及LPS刺激1,25（OH）2D3处理的DC形态观察1,25（OH）2D3处理的DC形态同不成熟DC相似，DC表面突起少而短。OVA及LPS刺激成熟的DC具有明显的长而多的树枝状突起。OVA及LPS刺激1,25（OH）2D3处理的DC的形态同不成熟DC类似，其表面树枝状突起短而偏少，有别于成熟DC明显长而多的树枝状突起形态。1.2OVA及LPS刺激对1,25（OH）2D3处理的DC吞噬功能的影响1,25（OH）2D3处理的DC吞噬功能比不成熟DC更强（P<0.05）。 OVA及LPS刺激DC成熟后其吞噬功能明显降低。OVA及LPS刺激1,25（OH）2D3处理的DC仍有相对较强的吞噬功能，其吞噬强度同不成熟DC相当（P>0.05）。可见，1,25（OH）2D3增强了DC的吞噬功能，OVA及LPS的刺激不能削弱1,25（OH）2D3处理的DC的吞噬功能。1.3OVA及LPS刺激对1,25（OH）2D3处理的DC表面共刺激分子CD80、CD86、CD40及MHCⅡ表达的影响1,25（OH）2D3处理的DC表面共刺激分子CD80、CD86、CD40及MHCⅡ表达均明显低于不成熟DC的共刺激分子CD80、CD86、CD40及MHCⅡ表达（均P <0.001）。OVA及LPS刺激1,25（OH）2D3处理的DC表达CD86及MHCⅡ均高于不成熟DC（P<0.05），但CD80及CD40与不成熟DC相当（均P>0.05），但均低于OVA及LPS活化的成熟DC表达的CD80、CD86、CD40及MHCⅡ （均P<0.001）。结果表明，1,25（OH）2D3显著抑制DC成熟，1,25（OH）2D3处理的DC为不成熟DC的表型。OVA及LPS的刺激使1,25（OH）2D3处理的DC由不成熟DC的表型转变为半成熟DC的表型。2. OVA及LPS刺激对1,25（OH）2D3处理的DC功能的影响2.1OVA及LPS刺激对1,25（OH）2D3处理的DC分泌IL-6、IL-12p70及IL-10水平的影响不成熟DC几乎不分泌IL-6、IL-12p70及IL-10。1,25（OH）2D3处理的DC低分泌IL-6及IL-12p70，促进IL-10分泌。OVA及LPS刺激成熟的DC分泌大量的IL-6及IL-12p70，低分泌IL-10。与成熟的DC分泌大量IL-6及IL-12p70及IL-10相比，OVA及LPS刺激1,25（OH）2D3处理的DC低分泌IL-6及IL-12p70（均P<0.001），但分泌大量的IL-10（均P<0.001）。这表明1,25（OH）2D3抑制DC分泌IL-6及IL-12，促进IL-10分泌。2.21,25（OH）2D3处理的DC对OVA及LPS驱动的CD4+T细胞增殖的影响与成熟的DC显著刺激CD4+T细胞增殖相比，1,25（OH）2D3明显抑制OVA及LPS驱动的CD4+T细胞增殖（P值从0.01至0.001）。2.31,25（OH）2D3处理的DC诱导Treg细胞能力1,25（OH）2D3处理的DC抑制OVA驱动的CD4+CD25-T细胞向CD4+CD25+Foxp3-效应性T细胞分化（39.5±5.2%vs51.2±12.0%），促进CD4+CD25-T细胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞分化（32.6±5.7%vs5.5±0.3%）；与此类似的结果是1,25（OH）2D3处理的DC也抑制了LPS驱动的CD4+CD25-T细胞向CD4+CD25+Foxp3-效应性T细胞分化（32.5±5.4%vs69.4±1.7%），促进CD4+CD25-T细胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞分化（42.1±1.6%vs6.6±1.7%）。2.4OVA及LPS刺激对1,25（OH）2D3处理的DC表面CCR5、CCR7及CXCR4表达的影响不成熟DC及1,25（OH）2D3处理的DC均高表达CCR5，但1,25（OH）2D3处理的DC表达CCR5更高（46.3±2.6%vs24.9±4.1%）（P<0.01）。这表明1,25（OH）2D3处理的DC迁移至淋巴组织的能力不足。OVA及LPS刺激成熟的DC均高表达CCR7，表明成熟DC迁移至淋巴组织能力较强。与不成熟DC表达的CCR5及CCR7及CXCR4相比，OVA及LPS刺激1,25（OH）2D3处理的DC CCR5表达均明显降低，CCR7表达明显增高，但CXCR4表达无明显变化。结果表明，1,25（OH）2D3处理的DC迁移能力较弱，OVA及LPS刺激可能使1,25（OH）2D3处理的DC获得向淋巴组织迁移的能力。第三章： HVEM在1,25（OH）2D3处理的DC促进Treg细胞分化中的作用1. OVA及LPS刺激对1,25（OH）2D3处理的DC分泌IL-2水平的影响不成熟DC及1,25（OH）2D3处理的DC几乎不分泌IL-2。与OVA及LPS刺激的成熟DC分泌大量IL-2相比，1,25（OH）2D3处理的DC经OVA及LPS刺激后仍然低分泌IL-2（P<0.001）。表明，1,25（OH）2D3处理的DC促进初始型T细胞向Treg细胞分化不依赖DC分泌IL-2。2.1,25（OH）2D3处理的DC表面抑制性分子HVEM、PDL1、PDL2表达的影响2.1FACS结果表明不成熟DC及成熟DC均低表达HVEM。1,25（OH）2D3处理的DC表达HVEM明显上调，与不成熟DC相比，HVEM表达增高了21倍。1,25（OH）2D3处理的DC在OVA及LPS刺激后HVEM表达仍然相对较高，与OVA及LPS刺激的成熟DC相比，HVEM表达上调分别增加4.1倍及5.8倍。PD-L1表达在OVA及LPS刺激1,25（OH）2D3处理的DC上调仅增加1.0倍及0.9倍。PD-L2表达在OVA及LPS刺激1,25（OH）2D3处理的DC是下调的。以上结果提示1,25（OH）2D3处理的DC表达抑制性分子HVEM的上调可能与其诱导Treg细胞有关。2.2Real-time RT-PCR检测1,25（OH）2D3处理的DC表达HVEM明显上调，与不成熟DC相比，HVEM表达增高了17倍。OVA及LPS刺激1,25（OH）2D3处理的DCHVEM表达分别较OVA及LPS活化的成熟DC增高3.38倍及3.62倍。进一步证实了HVEM在1,25（OH）2D3处理的DC高表达。3. HVEM对1,25（OH）2D3处理的DC诱导Treg细胞分化的影响3.1HVEM对OVA刺激1,25（OH）2D3处理的DC诱导Th2/Treg细胞分化的影响被HVEM单克隆抗体封闭的OVA-D3/imDC与CD4+CD25-T细胞共培养，促进Treg细胞分化的作用减弱，共培养上清中IL-10水平及Foxp3转录水平分别降低1.4倍及3.1倍；抑制Th2细胞分化的作用减弱，共培养上清中IL-4及GATA-3转录水平水平分别增高2.2倍及1.6倍。3.2HVEM对LPS刺激1,25（OH）2D3处理的DC诱导Th1/Treg细胞分化的影响被HVEM单克隆抗体封闭的LPS-D3/imDC与CD4+CD25-T细胞共培养，促进Treg细胞分化的作用减弱，共培养上清中IL-10水平及Foxp3转录水平分别降低1.7倍及2.1倍。抑制Th1细胞分化的作用减弱，共培养上清中INF-γ水平及T-bet mRNA分别增高3.5倍及2.5倍。4. HVEM对1,25（OH）2D3处理的DC抑制OVA及LPS驱动的CD4+T淋巴细胞增殖的影响被HVEM单克隆抗体封闭的OVA-D3/imDC及LPS-D3/imDC分别与CD4+T细胞共培养，其抑制CD4+T淋巴细胞增殖能力均明显降低（均P<0.01）。表明，1,25（OH）2D3处理的DC抑制OVA及LPS驱动的CD4+T细胞增殖部分依赖于抑制性分子HVEM的的上调。以上结果表明，抑制性分子HVEM的上调与1,25（OH）2D3处理的DC促进Treg细胞分化、扩增，抑制效应性T细胞分化、增殖有重要作用。研究结论与意义：1.1,25（OH）2D3处理的DC有耐受性DC的特性。1,25（OH）2D3处理的DC促进初始型T细胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞分化，抑制OVA及LPS驱动的效应性CD4+T细胞增殖。2.1,25（OH）2D3处理的DC高表达HVEM。被HVEM单克隆抗体封闭的1,25-二羟维生素D3处理的DC促进Treg细胞分化及抑制Th2/Th1细胞增殖的能力被明显削弱了。这表明，抑制性分子HVEM对于1,25（OH）2D3处理的DC促进Treg细胞分化、扩增，抑制效应性T细胞分化、增殖很重要。HVEM在1,25（OH）2D3诱导耐受性DC，促进Treg细胞分化中的重要作用，进一步表明除共刺激分子外，抑制性分子在DC介导的免疫耐受中有重要作用。为今后设计HVEM过表达的DC免疫治疗哮喘提供了新的思路。