由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是一种世界性的重要病害,常给农业生产造成重大的经济损失。分离植物抗灰霉病相关基因,研究其抗病分子机制,进而培育抗病新品种是防治灰霉病的有效途径。本实验室前期通过筛选拟南芥的T-DNA插入突变体库获得了一株对灰葡萄孢敏感的突变体,利用TAIL-PCR技术和生物信息学方法确定了突变体的突变基因为T1N6₂2,推测T1N6₂2基因为拟南芥的抗灰霉病相关基因。为进一步确定该基因的功能及其在抗病过程中的具体作用,本研究对t1n6₂2突变体进行分子鉴定和抗病性测定,明确了t1n6₂2突变体对灰葡萄孢的敏感性和对丁香假单胞杆菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000,Pst DC3000）的抗病性。通过互补回复试验,验证了T1N6₂2基因为拟南芥抗灰葡萄孢相关基因。利用RT-PCR和Real-Time PCR技术,确定了T1N6₂2基因是通过水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）信号途径影响拟南芥对灰葡萄孢的抗性。利用黄色荧光蛋白YFP融合蛋白技术,确定了T1N6₂2蛋白定位于叶绿体。利用酵母双杂交技术筛选拟南芥cDNA文库,获得T1N6₂2的互作蛋白。为进一步阐明T1N6₂2基因抗灰霉病的分子机制及植物抗病育种奠定了良好基础。1.对t1n6₂2突变体进行分子鉴定,确定了其纯合突变体为T1N6₂2基因的功能缺失突变体。检测t1n6₂2突变体对灰葡萄孢的抗病性,发现t1n6₂2突变体表现为明显的感病症状（野生型为抗病症状）;t1n6₂2突变体中灰葡萄孢ACTIN基因的表达水平明显高于野生型;台盼蓝染色和DAB染色法确定t1n6₂2突变体叶片中死亡细胞数量和H2O2的积累量均明显高于野生型,进一步确定了t1n6₂2突变体对灰葡萄孢的敏感性。检测t1n6₂2突变体对Pst DC3000的抗病性,发现t1n6₂2突变体表现明显的抗性（野生型感病）,采用间苯胺蓝染色法检测到t1n6₂2突变体中胼胝质大量积累,进一步验证了t1n6₂2突变体对Pst DC3000的抗病性。2.通过农杆菌介导法将构建好的T1N6₂2基因回复表达载体pCAMBIA1300-Pro35S∷T1N6₂2（CDS）-NOS转化至t1n6₂2突变体中,抗生素筛选获得了T1N6₂2基因的转基因回复株系;利用PCR和Southern blotting鉴定,确定了T1N6₂2基因以多拷贝形式成功整合到t1n6₂2突变体基因组中;利用RT-PCR技术分析,确定了转基因株系中T1N6₂2基因及抗病防御相关基因的表达恢复到了野生型水平;抗病性测定发现,回复转基因株系恢复了对灰葡萄孢的抗病性和对Pst DC3000的感病性,进一步确定了T1N6₂2基因为拟南芥抗灰霉病相关基因。3.利用RT-PCR技术,对拟南芥野生型Col-0经SA类似物BTH、乙烯合成前体ACC、SA及JA处理后T1N6₂2基因的表达情况进行分析,发现SA及其类似物BTH处理后该基因的表达明显增强,JA处理该基因的表达明显减弱,ACC处理该基因的表达没有明显变化,表明T1N6₂2基因的表达受SA的诱导和JA的抑制。将JA合成缺失突变体jar1用JA处理,检测T1N6₂2基因的表达情况,发现Col-0中T1N6₂2在JA处理后下调表达,而jar1突变体中T1N6₂2的表达没有明显变化,说明T1N6₂2的表达受JA信号途径的调控。将SA信号途径相关突变体NahG、eds5、sid2和npr1用SA处理,检测T1N6₂2的表达情况,发现各突变体中T1N6₂2基因的表达明显减弱,说明T1N6₂2的表达受SA信号途径的调控。4.利用RT-PCR和Real-Time PCR技术,检测野生型Col-0、t1n6₂2突变体及回复株系接种灰葡萄孢后抗病相关基因的表达情况,发现t1n6₂2突变体中PR1、PR3、PR5及PDF1.2基因的表达变化趋势与野生型明显不同。对野生型Col-0、t1n6₂2突变体及回复株系接种Pst DC3000后,检测T1N6₂2及抗病相关基因的表达情况,发现t1n6₂2突变体中PR1、PR3、PR5及NPR1基因的表达趋势与野生型明显不同,说明T1N6₂2基因的功能缺失破坏了SA和JA/ET的抗病信号途径。5.试验构建了T1N6₂2基因与YFP融合的植物表达载体,采用原生质体转化的方法,将此载体导入拟南芥原生质体中进行瞬时表达,用荧光显微镜观察其在原生质体中的分布情况,初步确定了T1N6₂2蛋白定位于叶绿体。6.试验构建了T1N6₂2基因的酵母诱饵表达载体,转录激活活性分析确定T1N6₂2具有较强的转录激活活性。以T1N6₂2为诱饵,利用酵母双杂交体系筛选拟南芥cDNA文库,并利用PCR技术初步验证,共获得了4个可能与T1N6₂2互作的蛋白,对其进行生物信息学分析,发现4个T1N6₂2互作蛋白均为核小体组装相关蛋白。