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背景
目前研发既具有抗感染能力又具有促成骨功能的三维立体支架来治疗感染性骨缺损在科研领域仍是一项非常具有挑战的难题。组织工程骨在促进骨的再生方面具有相当大的潜力，因为其通常具备一定机械能力和骨再生能力。但是对于感染性骨缺损的治疗，只具备骨传导和骨诱导能力的骨支架则难以满足治疗需求。目前已经明确，以金黄色葡萄球菌为主的细菌在骨内缺血部位和植入物表面形成生物膜来对抗机体自身的免疫能力和抗生素的杀菌作用是导致骨感染治疗的主要困难，因此，研制具有缓释针对金葡菌和生物膜效果好的抗生素，同时有骨传导和骨诱导作用的生物可降解骨支架对临床治疗感染性骨缺损的病人意义重大。
目前文献报道用于骨缺损重建的骨支架材料有生物陶瓷和可降解高分子聚酯类。生物陶瓷是一种优良的组织工程骨材料，具备良好的骨传导性和骨诱导性能有效促进成骨，如磷酸三钙(TCP)、生物玻璃、羟基磷灰石(HA)。但其较高的脆性、不稳定的机械性能和缓慢的降解速度又限制了其在骨组织工程方面的应用。高分子聚酯类是在生物医用材料方面广泛应用的一类材料，如PCL、PLLA、PLGA等。因为其具备优良的可降解性能、生物相容性和机械性能，目前更多被用于制备组织工程骨支架材料。高分子聚酯类也可以与其他生物陶瓷类材料混合制备骨支架，混合后可以增强高分子聚酯类支架的力学性能和骨诱导作用。对于感染性骨缺损的治疗除了用支架填充缺损促进骨折愈合，另一方面的需求则是支架具备一定的抗感染能力。目前应用的方法有在支架表面涂层或应用有抑制细菌粘附的材料制备支架从而达到抑制细菌的目的，这类支架仅有预防感染作用，对于已感染部位无明显效果。还有将抗生素直接与支架材料混合来制备支架使抗生素能达到局部缓释抗感染的作用，因为支架通常需要达到一定力学性能，相对降解较为缓慢，所以支架内抗生素释放缓慢，经常达不到杀菌浓度，更容易诱发细菌耐药性的出现。
基于以上背景，我们先制备载针对金葡菌和生物膜的双联抗生素的PLGA微球，使微球达到较高的载药量和包封率，长的缓释时间和稳定释药量。通过体外抑菌实验证实微球中所载药物的有效性，及载双联抗生素微球的抗菌性强于载单药微球。在第二部分实验中通过3D打印制备单纯的PLLA支架，之后将具有成骨活性因子的珍珠粉和载双联抗生素微球共同加载于支架表面和孔隙内，通过体外实验评估该支架的抗感染性能和成骨性能。在体内实验评估该支架治疗感染性骨缺损的性能。
目的
将利福平和莫西沙星两种抗生素共同包载于PLGA微球中，考察微球性状并体外明确载双联抗生素微球抗菌性能强于载单药微球；通过3D打印技术体外制备单纯PLLA三维支架，并将制备的载双联抗生素微球和珍珠粉复合于支架中，对支架进行体外和体内评价，明确支架的抗菌性能、抗细菌生物膜性能、细胞相容性和成骨性能。
方法
1、通过复乳-溶剂挥发法制备载莫西沙星PLGA微球、载莫西沙星/利福平双联抗生素PLGA微球，并通过考察微球的表面性状、粒径、载药量、包封率来评价两种微球；对两种微球进行体外释放，在一周内按照预设的时间点收集缓释液，用高效液相法测定每个时间点的每种药物的缓释量，明确微球的体外缓释情况。收集两种微球缓释液，采用纸片扩散法(K-B法)和时间杀菌实验检测两种抗菌微球的体外抑菌作用。
2、通过3D打印技术制备单纯PLLA支架；再通过将载药微球和珍珠粉混悬于羧甲基纤维素溶液中并将支架浸泡，干燥后获得PLLA/珍珠粉和PLLA/珍珠粉/抗菌微球支架。通过X射线电子能谱仪(XRD)分析支架内元素分布情况；用扫描电镜(SEM)观察支架表征特点，评估支架的力学性能。将支架完全浸入装有PBS的透析袋中，并将透析袋放入烧杯中在摇床中模拟体内降解，并按预设时间点取出烧杯中释放液，高效液相色谱法测定释放液中两种抗生素含量，测定降解液中PH值变化和Ca离子浓度。
3、通过涂布平板法测定PLLA/珍珠粉/抗菌微球支架对金黄色葡萄球菌的抑菌能力；通过结晶紫实验定性和定量测定PLLA/珍珠粉/抗菌微球对金黄色葡萄球菌生物膜的抑制作用；将单纯PLLA支架、PLLA/珍珠粉支架和PLLA/珍珠粉/抗菌微球支架在同浓度金葡菌溶液中培养24小时，将支架表面细菌生物膜通过荧光染色后在激光共聚焦下观察其生物膜形态。在支架表面培养人骨髓间充质干细胞，利用CCK-8试剂盒检测支架对细胞的粘附性和增殖活性，利用MTT法检测所培养细胞的ALP活性。
4、取雌性成年新西兰大白兔27只，在每只大白兔左侧桡骨中段处造6mm骨缺损模型，分别将三种支架和等量菌液植入缺损部位。术后观察兔大体情况和切口愈合情况；术后2周、4周和8周对兔支架植入部位进行X线检查观察骨缺损部有无炎性反应，用改良Norden骨髓炎评分法定量评定三组兔桡骨骨髓炎形成情况，术后4周和8周对兔支架植入部位进行Micro-CT检查，评价植入材料处的骨愈合情况。术后8周将大白兔处死，检测支架表面和临近骨内微生物数量，明确细菌生物膜中死活菌数量；对骨支架及其周围组织进行病理切片染色评估骨感染和新骨形成情况。
结果
1、通过复乳-溶剂挥发法成功制备出了载利福平/莫西沙星PLGA微球和载莫西沙星PLGA微球，载莫西沙星/利福平双联抗生素PLGA微球较载莫西沙星PLGA微球的表面更光滑、载药量和包封率更高，说明两种抗生素可以共同载入PLGA微球中并且每种药均可达到较高的载药量和包封率；通过两种微球缓释液的体外抑菌实验证实载双联抗生素PLGA微球较载单药PLGA微球具有更强的体外抑菌能力。
2、通过3D打印技术首先打印出单纯PLLA支架，在通过浸泡干燥法获得PLLA/珍珠支架和PLLA/珍珠粉/抗菌微球支架；经XRD分析可以看出三种支架内存在不同组成成分；扫描电镜下可以观察到粘附有形状完整的抗菌微球；PLLA/珍珠粉支架和PLLA/珍珠粉/抗菌微球支架的孔隙率小于单纯PLLA支架；力学性能评价加入珍珠粉的复合支架力学性能强于单纯PLLA支架；支架体外缓释抗生素平稳。
3、涂布平板实验显示粘附于PLLA/珍珠粉/载抗菌微球上的细菌数量明显少于单纯PLLA支架和PLLA/珍珠粉支架；结晶紫实验显示PLLA/珍珠粉/载抗菌微球支架较单纯PLLA支架和PLLA/珍珠粉支架吸光度值明显降低；荧光染色后激光共聚焦显微镜观察并构建细菌生物膜三维图像显示PLLA/珍珠粉/载抗菌微球支架表面形成生物膜的死细胞数量较其他两种支架数量明显增多。三种支架对骨髓间充质干细胞均有一定的粘附性和增殖性；而PLLA/珍珠粉支架和PLLA/珍珠粉载/抗菌微球支架表面对细胞的粘附和增殖性均明显高于单纯PLLA支架。
4、术后4周内兔一般情况良好，无全身菌血症表现；术后2周、4周、8周的X线表现证实除PLLA/珍珠粉/抗菌微球支架组，其他两组植入部位出现骨膜反应、骨破坏和死骨形成。骨髓炎的影像学评分在单纯PLLA支架组和PLLA/珍珠粉支架组均明显高于PLLA/珍珠粉/抗菌微球支架组。术后4周和8周行Micro-CT检查示在PLLA/珍珠粉/抗菌微球支架组有新骨长入，而其他两组仍有骨髓炎表现为主；微生物检测表明单纯PLLA支架组和PLLA/珍珠粉支架组的骨支架表面及周围骨组织内的活菌数量明显多于PLLA/珍珠粉/抗菌微球支架组。病理学检查可见PLLA/珍珠粉/抗菌微球支架组内有少量的炎性细胞及周围有新骨形成和骨长入。
结论
1、利福平/莫西沙星双联抗生素可共同载入PLGA微球中，并且联合载药微球体外有更强的抗菌性能。
2、PLLA/珍珠粉/抗菌微球支架中珍珠粉和抗菌微球均匀分布，孔隙率符合组织工程骨要求，力学性能良好；PLLA/珍珠粉/抗菌微球支架在体外降解过程中均匀缓释抗生素。
3、载双联抗生素PLGA微球复合PLLA/珍珠粉体外抗菌性能和抗细菌生物膜性能良好；且该支架具备良好的细胞相容性。
4、PLLA/珍珠粉/抗菌微球骨支架在体内具备良好的抗感染能力和修复骨缺损的能力。
目前研发既具有抗感染能力又具有促成骨功能的三维立体支架来治疗感染性骨缺损在科研领域仍是一项非常具有挑战的难题。组织工程骨在促进骨的再生方面具有相当大的潜力，因为其通常具备一定机械能力和骨再生能力。但是对于感染性骨缺损的治疗，只具备骨传导和骨诱导能力的骨支架则难以满足治疗需求。目前已经明确，以金黄色葡萄球菌为主的细菌在骨内缺血部位和植入物表面形成生物膜来对抗机体自身的免疫能力和抗生素的杀菌作用是导致骨感染治疗的主要困难，因此，研制具有缓释针对金葡菌和生物膜效果好的抗生素，同时有骨传导和骨诱导作用的生物可降解骨支架对临床治疗感染性骨缺损的病人意义重大。
目前文献报道用于骨缺损重建的骨支架材料有生物陶瓷和可降解高分子聚酯类。生物陶瓷是一种优良的组织工程骨材料，具备良好的骨传导性和骨诱导性能有效促进成骨，如磷酸三钙(TCP)、生物玻璃、羟基磷灰石(HA)。但其较高的脆性、不稳定的机械性能和缓慢的降解速度又限制了其在骨组织工程方面的应用。高分子聚酯类是在生物医用材料方面广泛应用的一类材料，如PCL、PLLA、PLGA等。因为其具备优良的可降解性能、生物相容性和机械性能，目前更多被用于制备组织工程骨支架材料。高分子聚酯类也可以与其他生物陶瓷类材料混合制备骨支架，混合后可以增强高分子聚酯类支架的力学性能和骨诱导作用。对于感染性骨缺损的治疗除了用支架填充缺损促进骨折愈合，另一方面的需求则是支架具备一定的抗感染能力。目前应用的方法有在支架表面涂层或应用有抑制细菌粘附的材料制备支架从而达到抑制细菌的目的，这类支架仅有预防感染作用，对于已感染部位无明显效果。还有将抗生素直接与支架材料混合来制备支架使抗生素能达到局部缓释抗感染的作用，因为支架通常需要达到一定力学性能，相对降解较为缓慢，所以支架内抗生素释放缓慢，经常达不到杀菌浓度，更容易诱发细菌耐药性的出现。
基于以上背景，我们先制备载针对金葡菌和生物膜的双联抗生素的PLGA微球，使微球达到较高的载药量和包封率，长的缓释时间和稳定释药量。通过体外抑菌实验证实微球中所载药物的有效性，及载双联抗生素微球的抗菌性强于载单药微球。在第二部分实验中通过3D打印制备单纯的PLLA支架，之后将具有成骨活性因子的珍珠粉和载双联抗生素微球共同加载于支架表面和孔隙内，通过体外实验评估该支架的抗感染性能和成骨性能。在体内实验评估该支架治疗感染性骨缺损的性能。
目的
将利福平和莫西沙星两种抗生素共同包载于PLGA微球中，考察微球性状并体外明确载双联抗生素微球抗菌性能强于载单药微球；通过3D打印技术体外制备单纯PLLA三维支架，并将制备的载双联抗生素微球和珍珠粉复合于支架中，对支架进行体外和体内评价，明确支架的抗菌性能、抗细菌生物膜性能、细胞相容性和成骨性能。
方法
1、通过复乳-溶剂挥发法制备载莫西沙星PLGA微球、载莫西沙星/利福平双联抗生素PLGA微球，并通过考察微球的表面性状、粒径、载药量、包封率来评价两种微球；对两种微球进行体外释放，在一周内按照预设的时间点收集缓释液，用高效液相法测定每个时间点的每种药物的缓释量，明确微球的体外缓释情况。收集两种微球缓释液，采用纸片扩散法(K-B法)和时间杀菌实验检测两种抗菌微球的体外抑菌作用。
2、通过3D打印技术制备单纯PLLA支架；再通过将载药微球和珍珠粉混悬于羧甲基纤维素溶液中并将支架浸泡，干燥后获得PLLA/珍珠粉和PLLA/珍珠粉/抗菌微球支架。通过X射线电子能谱仪(XRD)分析支架内元素分布情况；用扫描电镜(SEM)观察支架表征特点，评估支架的力学性能。将支架完全浸入装有PBS的透析袋中，并将透析袋放入烧杯中在摇床中模拟体内降解，并按预设时间点取出烧杯中释放液，高效液相色谱法测定释放液中两种抗生素含量，测定降解液中PH值变化和Ca离子浓度。
3、通过涂布平板法测定PLLA/珍珠粉/抗菌微球支架对金黄色葡萄球菌的抑菌能力；通过结晶紫实验定性和定量测定PLLA/珍珠粉/抗菌微球对金黄色葡萄球菌生物膜的抑制作用；将单纯PLLA支架、PLLA/珍珠粉支架和PLLA/珍珠粉/抗菌微球支架在同浓度金葡菌溶液中培养24小时，将支架表面细菌生物膜通过荧光染色后在激光共聚焦下观察其生物膜形态。在支架表面培养人骨髓间充质干细胞，利用CCK-8试剂盒检测支架对细胞的粘附性和增殖活性，利用MTT法检测所培养细胞的ALP活性。
4、取雌性成年新西兰大白兔27只，在每只大白兔左侧桡骨中段处造6mm骨缺损模型，分别将三种支架和等量菌液植入缺损部位。术后观察兔大体情况和切口愈合情况；术后2周、4周和8周对兔支架植入部位进行X线检查观察骨缺损部有无炎性反应，用改良Norden骨髓炎评分法定量评定三组兔桡骨骨髓炎形成情况，术后4周和8周对兔支架植入部位进行Micro-CT检查，评价植入材料处的骨愈合情况。术后8周将大白兔处死，检测支架表面和临近骨内微生物数量，明确细菌生物膜中死活菌数量；对骨支架及其周围组织进行病理切片染色评估骨感染和新骨形成情况。
结果
1、通过复乳-溶剂挥发法成功制备出了载利福平/莫西沙星PLGA微球和载莫西沙星PLGA微球，载莫西沙星/利福平双联抗生素PLGA微球较载莫西沙星PLGA微球的表面更光滑、载药量和包封率更高，说明两种抗生素可以共同载入PLGA微球中并且每种药均可达到较高的载药量和包封率；通过两种微球缓释液的体外抑菌实验证实载双联抗生素PLGA微球较载单药PLGA微球具有更强的体外抑菌能力。
2、通过3D打印技术首先打印出单纯PLLA支架，在通过浸泡干燥法获得PLLA/珍珠支架和PLLA/珍珠粉/抗菌微球支架；经XRD分析可以看出三种支架内存在不同组成成分；扫描电镜下可以观察到粘附有形状完整的抗菌微球；PLLA/珍珠粉支架和PLLA/珍珠粉/抗菌微球支架的孔隙率小于单纯PLLA支架；力学性能评价加入珍珠粉的复合支架力学性能强于单纯PLLA支架；支架体外缓释抗生素平稳。
3、涂布平板实验显示粘附于PLLA/珍珠粉/载抗菌微球上的细菌数量明显少于单纯PLLA支架和PLLA/珍珠粉支架；结晶紫实验显示PLLA/珍珠粉/载抗菌微球支架较单纯PLLA支架和PLLA/珍珠粉支架吸光度值明显降低；荧光染色后激光共聚焦显微镜观察并构建细菌生物膜三维图像显示PLLA/珍珠粉/载抗菌微球支架表面形成生物膜的死细胞数量较其他两种支架数量明显增多。三种支架对骨髓间充质干细胞均有一定的粘附性和增殖性；而PLLA/珍珠粉支架和PLLA/珍珠粉载/抗菌微球支架表面对细胞的粘附和增殖性均明显高于单纯PLLA支架。
4、术后4周内兔一般情况良好，无全身菌血症表现；术后2周、4周、8周的X线表现证实除PLLA/珍珠粉/抗菌微球支架组，其他两组植入部位出现骨膜反应、骨破坏和死骨形成。骨髓炎的影像学评分在单纯PLLA支架组和PLLA/珍珠粉支架组均明显高于PLLA/珍珠粉/抗菌微球支架组。术后4周和8周行Micro-CT检查示在PLLA/珍珠粉/抗菌微球支架组有新骨长入，而其他两组仍有骨髓炎表现为主；微生物检测表明单纯PLLA支架组和PLLA/珍珠粉支架组的骨支架表面及周围骨组织内的活菌数量明显多于PLLA/珍珠粉/抗菌微球支架组。病理学检查可见PLLA/珍珠粉/抗菌微球支架组内有少量的炎性细胞及周围有新骨形成和骨长入。
结论
1、利福平/莫西沙星双联抗生素可共同载入PLGA微球中，并且联合载药微球体外有更强的抗菌性能。
2、PLLA/珍珠粉/抗菌微球支架中珍珠粉和抗菌微球均匀分布，孔隙率符合组织工程骨要求，力学性能良好；PLLA/珍珠粉/抗菌微球支架在体外降解过程中均匀缓释抗生素。
3、载双联抗生素PLGA微球复合PLLA/珍珠粉体外抗菌性能和抗细菌生物膜性能良好；且该支架具备良好的细胞相容性。
4、PLLA/珍珠粉/抗菌微球骨支架在体内具备良好的抗感染能力和修复骨缺损的能力。