贵州百里杜鹃林区杜鹃属植物挥发性萜类物质研究

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化感物质广泛分布于植物体的组织器官,通过自然途径(淋溶、挥发、残体分解和根分泌)进入环境并发挥作用,不同植物向周围环境释放化感物质的方式不尽相同。其中,植物向体外释放挥发性萜类物质是一个主要途径,大量挥发性萜类的散布会造成林内郁闭度高,导致严重的可持续发展障碍。杜鹃属植物作为百里杜鹃林区最重要的森林资源之一,具有重要的经济、环境、健康等价值。针对百里杜鹃林区结构单一,林下种子更新困难等生态问题,为了明确影响杜鹃群落天然更新的化学因子,本论文选取贵州省百里杜鹃林区内的长蕊杜鹃(Rhododendron stamineum)、大白杜鹃(Rhododendron decorum)、马缨杜鹃(Rhododendron delavayi)、迷人杜鹃(Rhododendron agastum)、露珠杜鹃(Rhododendron irroratum)及桃叶杜鹃(Rhododendron annae)这六个主要杜鹃种类为研究对象,建立了一种基于顶空固相微萃取(HS-SPME)与全二维气相色谱(GC×GC)相结合的检测方法,同时采用四极杆飞行时间质谱和氢火焰离子化检测器(QTOFMS/FID)为定性定量方法对杜鹃花的挥发性萜类化合物进行检测与分析,研究了百里杜鹃林区主要杜鹃种类不同组织挥发性萜类物质季节性变化,为百里杜鹃林区杜鹃群落可持续评价与管理提供数据支撑。经过本论文研究,得出以下结果:1.针对挥发性萜类化感物质的提取优化了前处理方法。本研究收集了六个主要的杜鹃种类(长蕊杜鹃、大白杜鹃、露珠杜鹃、马缨杜鹃、迷人杜鹃和桃叶杜鹃)的叶片(鲜叶和枯叶)、茎、根和花,将所得样品在真空冷冻干燥器中-70℃下冷冻干燥一周后磨成粉末后进行萃取和检测。采用顶空固相微萃取的前处理,并对影响杜鹃花挥发性萜类化合物提取效率的五个参数进行了优化,分别是固相微萃取涂层纤维、称样量、平衡温度、平衡时间和提取时间。方法优化实验结果显示,PDMS/DVB/CAR纤维头在70℃下平衡20 min,并提取15 min的条件下能获得最佳提取效率。为了将分析误差最小化,评估了SPME方法优化条件下样品的稳定性和可重复性。日内和日间精确度表示为相对标准偏差(RSD%),结果显示,主要萜类化合物结果表明几乎所有测试化合物的RSD均低于20%,说明建立方法条件的稳定性与可重复性。此外,SPME自动化进样还提高了再现性,不同杜鹃样品间化合物保留时间的一维和二维保留时间的相对标准偏差均小于1%,在可接受范围内的RSD值充分证明了HS-SPME/GC×GC-QTOFMS方法得到的数据具有稳定性和可重复性。2.建立了挥发性萜类化感物质的定性与定量分析方法。本文对比了一维气相色谱与全二维气相色谱对杜鹃挥发性萜类化合物的分离检测能力,结果证实了全二维气相色谱能检测出35种挥发性萜类化合物,而一维气相色谱只能分离出18种萜类化合物。利用GC×GC-QTOFMS对杜鹃化合物进行鉴定分析,通过将QTOFMS质谱数据与标准谱库(NIST 17)进行匹配,以最小匹配因子800对化合物的进行筛选,再结合精确分子质量进行判断,使其精确分子量偏差在5ppm以内,最后,保留指数信息被用于进一步化合物确认,实测值(RIexp)和文献值(RIlit)之间的可接受RI误差范围为0–40(|RIexp-RIlit|)。分别通过三种定性手段对所有萜类化合物进行了结构鉴定,最终确定了六个主要种类杜鹃中共35个萜类挥发性物质。在定量方面,本论文利用GC×GC-FID检测器进行定量检测,以内标1,4-桉树脑对目标化合物进行半定量分析。结果表明,单萜及其含氧衍生物是所有杜鹃种类的主要成分,其中,D-柠檬烯,对伞花烃,α-蒎烯和α-松油醇等为含量较高的化学成分,且这些萜类化合物都具有一定的化感特性。3.分析了杜鹃林下挥发性萜类化感物质的变化规律。本论文利用已建立的GC×GC-QTOFMS/FID方法考察不同种类杜鹃挥发性萜类化合物的变化特征,探讨不同部位和季节对挥发性萜类化合物的的影响。结果表明:(1)不同种类杜鹃的挥发性萜类化合物浓度具有明显差异,且单萜类物质含量明显高于倍半萜类物质;(2)杜鹃的枯叶和根部能够检测到更多的萜类化合物,表明杜鹃的挥发性萜类化合物可通过枯落叶腐殖化过程和根部分泌途径释放至外部环境;(3)在春季和秋季杜鹃能释放更多的挥发性萜类化合物;(4)采用多元统计方法,可将杜鹃地上部分(鲜叶,枯叶和茎)和地下部分(根)区域划分为三类,从种类内部解释其各部位之间所含萜类化合物内在联系。
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