用病毒治疗肿瘤这个思路最早可以追溯到100年前，但是直到近10年才取得了飞速的发展。与以往的研究以病毒作为基因载体不同，最近的研究集中在靶向性肿瘤增殖病毒(Cancer-specific Replication-competent Virus)上，该病毒经转录调节修饰后，可以以高度的特异性在目的肿瘤中复制并裂解肿瘤细胞，而对正常的体细胞无杀伤力。 靶向性肿瘤增殖病毒的构建方法之一就是将肿瘤细胞内特异性表达的启动子／增强子插入到腺病毒某些必须基因的上游，替代腺病毒基因原有的启动子，使该基因只能在肿瘤细胞内表达，而在其它正常细胞内处于沉默状态，使经改建后的腺病毒只能以高度的特异性在肿瘤细胞内增殖并杀伤肿瘤细胞，而对正常体细胞无明显杀伤力，从而达到特异性杀灭肿瘤的目的。 本课题拟以人端粒酶催化亚单位(human telomersse reverse transcriptase，hTERT)和人环氧合酶-2(Cyclo-oxygenase 2，Cox-2)不同长度的启动子作为腺病毒的增殖调控片断，使构建后的腺病毒只能在hTERT和Cox-2表达阳性的肿瘤细胞中特异性增殖，进而杀伤肿瘤细胞，而在正常体细胞内复制缺陷，具有高度的特异性和安全性。并通过比较筛选出特异性强、安全性高的转录调控片段作为腺病毒的调控序列。为下一步靶向性肿瘤增殖病毒治疗实体肿瘤奠定基础。浙江大学硕士学位论文 材料和方法: 以腺病毒穿梭载体Pd306(俞德超博士友情赠送)作为质粒载体，核查Genbank，设计特异性引物，通过PCR方法将hTERT和Cox一的不同长度的启动子片段从人基因组中扩增出来。并将扩增的片断分别插入到腺病毒穿梭载体pd300所携带的腺病毒的Ela和Elb启动调控区，连接所得质粒通过PCR、酶切、测序等方法进行鉴定。为下一步进行腺病毒在293细胞的包装、纯化、以及病毒感染各种肿瘤细胞、病毒感染治疗动物实体瘤模型奠定基础。 结果与讨论: 结果:通过不同的引物，从人基因组通过聚合酶联反应(PCR)亚克隆了hTERT的2个不同长度的启动子，大小分别为181bp、378bp。通过PCR亚克隆了Cox一2的2个不同长度的启动子，大小分别是400bp、8 14bp。将hTERT启动子片段通过Agel酶切，插入到经过Agel酶切、去磷酸化处理的po06上(Ela上游)，将Cox一2不同长度的启动子片段经过Eagl酶切，插入到经过Eagl酶切、去磷酸化处理的pd306上(Elb上游)。重组质粒经过转化到感受态细菌、质粒DNA抽提，重组质粒分别用对应的hTER’r和Cox一2启动子引物进行PCR扩增、Agel和Eagl酶切鉴定己含插入序列，最后经测序鉴定为正向克隆。将hTERT启动子准确插入腺病毒穿梭载体Pd306 Ela调控区，调控Ela的转录;将Cox一启动子插入到pd306 Elb的上游调控区域，调控Elb的转录。为下一步穿梭载体和腺病毒骨架质粒共转染293细胞进行病毒包装以及病毒感染肿瘤细胞和动物实验奠定基础。 讨论:基因治疗肿瘤已经有悠久的历史，而腺病毒是基因治疗的一个常用载体。既往用腺病毒作为载体表达外源性基因，相对于质粒等非病毒类载体具有转染能力强、瞬时表达效率高等特点，但是由于经典的非复制型腺病毒载体不能稳定表达、需要重复感染、且具有较大的毒副作用等缺点使腺病毒的应用受到了严格限制。而本课题拟构建的复制型新型腺病毒具有转染率高、感染性强、且具有肿瘤细胞靶向攻击能力，对正常细胞杀伤力低下，安全性高等特点。本课题采用肿瘤组织特异性表达的启动子调控腺病毒必须基因的表达的方法来改建腺病毒。腺病毒穿梭载体Pd306包括了腺病毒早期基因Ela和Elb，Ela编码病毒复制必须的早期转录因子，其编码的转录因子与宿主细胞的转录因子协调作用激活其他早期基因，并使受染细胞进入s期，是腺病毒复制的必须基因。Elb编码的蛋白和p53的N端作用抑制p53介导的细胞凋亡作用，维持病毒复制的稳定环境。非复制型载体就是由于El基因缺失而失去浙江大学硕士学位论文了在普通细胞(非病毒包装细胞)内的复制能力。本课题所构建的就是用肿瘤组织特异性表达的启动子(hTERT和Cox一2启动子C)分别调控Ela和Elb转录的腺病毒，使经改建后的腺病毒对肿瘤细胞具有特异性杀伤力，而在正常细胞内由于基因沉默而失去复制能力，即构建肿瘤组织特异性杀伤的基因病毒。 正常体细胞在复制过程中由于染色体末端端粒的不断缩短，最终导致染色体不稳定，最终引起细胞凋亡，失去复制能力，所以正常体细胞的复制能力是有限的。而肿瘤细胞具有永生化能力，可无限繁殖，其染色体末端端粒是稳定的，这归功于肿瘤细胞内端粒酶的表达。端粒酶以自身RNA为模板通过逆转录合成染色体末端端粒序列，维持染色体末端完整性而使肿瘤细胞具有无限复制能力，处于永生状态。端粒酶包括三部分，端粒酶RNA(hTR)、端粒酶相关蛋白(rTAP)、端粒酶催化亚基(hTERT)，hTR起模板作用，TAP功能尚未确定，bTERT起逆转录酶的活性。其中hTERT是端粒酶的核心部分，直接决定端粒酶的活性。hTERT基因在正常组织细胞中低表达或不表达，但在大部分肿瘤细胞中(90%)高表达，具有明显的肿瘤组织特异性，因此本课题