液体活检（liquid biopsy）是体外诊断的一个分支,主要通过检验血液来对疾病做出判断。随着精准医疗时代的来临,液体活检凭借其无创性、敏感性、动态性等特质在肿瘤诊断、孕期筛查等领域大显身手。尤其在肿瘤的早期筛查、分型诊断、用药指导和复发监测等方面,液体活检具有不可估量的发展前景,被《麻省理工学院科技评论》评选为“2015年十大突破技术”。预计2022年液体活检的市场规模将达到20.5亿美元,复合年增长率23.4%。循环肿瘤细胞（CTC）、循环DNA（ct DNA）和外泌体（exosomes）是液体活检的三大检测对象。外泌体是细胞分泌的直径40-150 nm的微小囊泡。它们在体液中自由流通,将信息传递给邻近的或远处的细胞,参与免疫调节和肿瘤转移等多种生理、病理过程。肿瘤来源的外泌体携带有一部分肿瘤细胞的细胞质和细胞膜成分。因此,相比于CTC和ct DNA,外泌体不仅数量远多于CTC,还同时携带有核酸、蛋白、脂类、多糖等多种肿瘤相关分子,是极具潜力的液体活检对象。现已知道,一些具有重要意义的分子,如HER2和PD-L1,会随外泌体从肿瘤组织进入血液。然而,肿瘤来源的外泌体在血液中的数量很少,现有的检测方法大部分是基于辣根过氧化物酶（HRP）催化的ELISA系统,由于灵敏度不够,常常带来假阴性结果。因此急需发展新型的外泌体高灵敏检测方法。Gaussia荧光素酶（Gluc）近年来受到越来越多的关注,相比于传统的荧光虫或海肾荧光素酶,具有发光效率高、分子量小、发光反应体系简单等优点。本研究的目的是基于Gluc催化发光系统发展新型的外泌体检测方法,从病人血液中检测外泌体表面的标志蛋白,为肿瘤的诊断和治疗提供依据。本文围绕这一目标,完成了如下研究内容:1、设计Gluc与链霉亲和素（SA）的融合蛋白Gluc-SA,在真核细胞表达系统中重组纯化,并用Western blots鉴定。验证Gluc-SA的发光效率以及发光值与自身浓度的线性关系。寻找底物的最佳浓度,优化催化发光检测参数,并在之后的实验中保持一致。验证Gluc-SA对生物素的识别能力,检验发光强度与生物素浓度之间的线性关系,计算最低检测限（LOD）。同时与HRP-SA检测生物素的结果对比。结果发现,所设计的Gluc-SA表达正确,催化发光效率高,线性度好,能够结合生物素,并在较宽范围内实现对生物素的定量检测,尤其在低浓度区间的线性关系优于常规的HRP催化显色系统,具有比HRP系统更低的LOD。2、为了寻找从样品中捕获外泌体的方法,将Gluc表达在HEK293T细胞分泌的外泌体上,制备了能够精确定量的外泌体标准品。发现一种常用的Maxi Sorp表面能够从样品中捕获外泌体,且效率高于CD63或CD9抗体。将外泌体与10%血浆混合,Maxi Sorp仍然能够捕获外泌体,且捕获的量与样品中外泌体的量成线性关系。结果表明,Maxi Sorp表面非常适合应用在血浆外泌体检测当中。3、结合Gluc-SA生物发光报告分子和Maxi Sorp表面捕获,构建了新型的外泌体表面标志物检测方法,包括样品的前处理、封闭、孵育、生物素化抗体识别、Gluc-SA结合和发光检测等步骤。利用该方法,从BT474细胞（HER2+）培养液中成功检测到外泌体HER2,而MB-MDA-231细胞（HER2-）培养液的检测发光值极低。为了进行定量检测,制备了表达PD-L1的外泌体作为标准品。进而绘制发光值-外泌体PD-L1含量的标准曲线,计算得到LOD。对头颈癌病人血浆外泌体PD-L1进行了定量检测,并与健康人的结果相对比。结果发现,本方法的检测结果与临床情况以及文献报道的传统方法检测外泌体的结果高度符合。综上所述,我们基于Gluc发光报告系统发展了一种新型的外泌体表面标志物的检测方法。该方法相比市面上的常规产品,操作更简单、成本更低、灵敏度更高。本研究有利于外泌体检测的临床转化,推动液体活检的应用研究。