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宫颈癌是全球女性中仅次于乳腺癌的第二大恶性肿瘤,宫颈癌高发年龄一般为3055周岁,近年来其发病有年轻化的趋势。溶瘤腺病毒是非常有前途的癌症基因治疗药物,因为它们具有在恶性肿瘤细胞中选择性复制的特点,能够导致肿瘤细胞的溶解和炎症,本研究使用的重组溶瘤腺病毒Ad-VT是本实验室[1]基于凋亡素基因Apoptin,肿瘤特异性启动子hTERTp,病毒复制必须基因E1A通过RAPAd.I腺病毒载体系统构建而成的具有肿瘤特异性复制和肿瘤特异性杀伤能力的溶瘤腺病毒。本实验室大量前期研究表明[2-4],Ad-VT构建方式可靠,能够稳定表达并且疗效显著,对胃癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、结直肠癌和前列腺癌等多种肿瘤细胞均具有显著的抑制作用,对正常的人体细胞无影响。前期研究表明Ad-VT完全具备进行后续实验的条件。目的:探究重组溶瘤腺病毒对人宫颈癌Hela细胞的抑制作用以及重组溶瘤腺病毒对Hela细胞凋亡的影响;进一步探究重组溶瘤腺病毒通过哪些途径诱导Hela细胞凋亡;最后重点研究Hela细胞线粒体凋亡途径。通过该研究对重组溶瘤腺病毒诱导肿瘤细胞凋亡途径进行初步认识。方法:1 Hela细胞线粒体提取与功能活性验证通过Minute线粒体分离试剂盒提取Hela细胞线粒体;通过Western Blot法检测提取出线粒体中线粒体内参蛋白COXⅣ水平从而验证线粒体纯度;通过检测提取出线粒体的ATP水平和活性氧水平验证线粒体的功能活性。2重组溶瘤腺病毒对Hela细胞抑制途径研究通过CCK-8法和乳酸脱氢酶释放实验明确重组溶瘤腺病毒对Hela细胞的抑制作用;通过Hoechst染色和AnnexinⅤ-FITC/PI流式检测探究重组溶瘤腺病毒对Hela细胞凋亡的影响;通过Transwell小室迁移实验和Biocoat小室侵袭实验探究重组溶瘤腺病毒对Hela细胞迁移和侵袭的影响;通过Western Blot法进行凋亡相关蛋白检测,初步研究重组溶瘤腺病毒诱导Hela细胞凋亡的途径。3重组溶瘤腺病毒通过线粒体途径诱导Hela细胞凋亡通过JC-1染色及JC-1流式检测探究重组溶瘤腺病毒对Hela细胞线粒体膜电位的影响;通过Minute线粒体分离试剂盒提取感染重组溶瘤腺病毒后的Hela细胞线粒体;通过对提取出的线粒体进行ATP和活性氧检测探究重组溶瘤腺病毒对Hela细胞线粒体功能活性的影响;通过Western Blot法检测线粒体凋亡途径相关蛋白的表达,初步研究重组溶瘤腺病毒诱导Hela细胞凋亡的线粒体途径。结果:1通过Minute线粒体分离试剂盒成功提取出了纯度较高且具有较好功能活性的线粒体。2通过CCK-8和乳酸脱氢酶释放试验,明确重组溶瘤腺病毒能够对Hela细胞起到抑制作用且该抑制作用具有显著时间效应和剂量效应,重组溶瘤腺病毒对Hela细胞抑制率依次为:Ad-VT>Ad-T>Ad-Vp3>Ad-Mock;通过Hoechst染色和AnnexinⅤ-FITC/PI流式检测明确重组溶瘤腺病毒通过诱导Hela细胞凋亡对其产生抑制作用,且4种重组溶瘤腺病毒诱导Hela细胞凋亡的能力依次为:Ad-VT>Ad-T>Ad-Vp3>Ad-Mock;通过Transwell小室迁移实验和Biocoat小室侵袭实验确定重组溶瘤腺病毒能够影响Hela细胞迁移和侵袭能力,且影响程度依次为:Ad-VT>Ad-T>Ad-Vp3>Ad-Mock;通过Western Blot法检测凋亡相关蛋白明确重组溶瘤腺病毒能够影响多种Hela细胞凋亡途径蛋白,从而对Hela细胞的凋亡起调控作用。3通过JC-1染色明确重组溶瘤腺病毒可以使Hela细胞线粒体膜电位降低,诱导Hela细胞发生早期凋亡,通过JC-1流式明确重组溶瘤腺病毒诱导Hela细胞早期凋亡具有显著的时间效应,且4种重组溶瘤腺病毒诱导Hela细胞早期凋亡的能力依次为:Ad-VT>Ad-T>Ad-Vp3>Ad-Mock;通过ATP和活性氧检测明确重组溶瘤腺病毒对Hela细胞线粒体的功能活性具有显著影响;通过Western Blot法初步明确重组溶瘤腺病毒通过调控AIF、Arts等线粒体凋亡途径相关蛋白诱导Hela细胞凋亡。结论:重组溶瘤腺病毒能够通过诱导Hela细胞凋亡对其起抑制作用;并且它可以通过多种途径诱导Hela细胞发生凋亡;其中最重要的途径是线粒体途径,重组溶瘤腺病毒通过影响线粒体凋亡途径相关蛋白的表达调控Hela细胞凋亡。