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研究背景和目的:鼻咽癌是一种发生于鼻咽顶侧壁的恶性肿瘤,发病率为耳鼻咽喉恶性肿瘤之首,尤其在亚洲是一种高度流行的癌症类型。鼻咽癌具有地域集中性、发病原因复杂、发病隐匿、高转移和高侵袭性等特点,临床上治疗方法以放疗为主,不良反应较多,且患者的总生存期较差,转移性鼻咽癌及复发性鼻咽癌患者尤为严重。因此,探索其发病机制,寻找新的药物及治疗靶点具有重要的意义。病理血管生成是肿瘤进展和转移的一个基本因素。本课题拟对鼻咽癌细胞外泌体micro RNA miR-144在内皮细胞血管生成中的作用及其机制进行深入研究。研究内容和方法:第一部分miR-144在鼻咽癌组织及细胞中的表达以及与血管生成的相关性1、qRT-PCR分别检测鼻咽癌组织及慢性鼻咽炎组织和鼻咽癌细胞C666-1、SUNE1及正常鼻咽细胞NP69中miR-144 m RNA的表达水平;2、原位杂交验证鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎组织中miR-144的表达;3、免疫组化检测鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎组织中CD31表达的阳性率,及与miR-144的相关性。第二部分miR-144在鼻咽癌细胞外泌体中的表达1、采用差速超速离心法分离提取NP69细胞和C666-1细胞、SUNE1细胞中的细胞外囊泡（Extracellular vesicles,EVs）;2、透射电镜观察不同细胞EVs的形态,纳米微粒跟踪分析EVs的粒径和浓度,Western Blot测定EVs的特征表面标记蛋白CD9、CD63、TSG101以及内质网膜蛋白calnexin,Zeta电位仪检测EVs的表面电荷;3、分别使用核糖核酸酶及Triton X-100处理NP69、C666-1、SUNE1源性的EVs,Taq Man miRNA方法检测不同方法处理的EVs中miR-144 m RNA的表达水平,以评估EVs膜的稳定性;4、qRT-PCR检测NP69、C666-1、SUNE1源性EVs中miR-144 m RNA的表达水平。第三部分鼻咽癌细胞外泌体miR-144对人脐静脉内皮细胞的作用1、PKH67标记不同细胞分离的EVs后,并与人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）共孵育,荧光显微镜下观察HUVECs在不同时间点对PKH67标记的EVs的摄取;2、qRT-PCR检测与不同细胞的EVs共培养的HUVECs中miR-144 m RNA的表达水平;3、miR-144差异转染C666-1、SUNE1后,分离提取其EVs与HUVECs共培养;qRT-PCR检测HUVECs中miR-144 m RNA的表达水平,Transwell小室实验检测HUVECs的迁移和侵袭,划痕实验检测HUVECs的迁移,并进行体外血管生成实验及体内基质胶塞实验评估血管生成。第四部分鼻咽癌细胞外泌体miR-144促进血管生成的机制1、计算机模拟分析预测miR-144与FBXW7 m RNA的3′UTR存在结合位点,进行荧光素酶报告以明确miR-144与FBXW7的连接关系;2、qRT-PCR检测鼻咽癌组织、慢性鼻咽炎组织及NP69、C666-1、SUNE1中FBXW7 m RNA的表达水平,Western Blot及免疫组化分别检测鼻咽癌组织及慢性鼻咽炎FBXW7的蛋白水平及FBXW7表达的阳性率,并分析组织中miR-144与FBXW7的相关性;3、miR-144差异转染C666-1、SUNE1后,分离其EVs与HUVECs共培养,qRT-PCR检测其FBXW7、HIF-1αm RNA的表达水平,Western Blot检测FBXW7、HIF-1α的蛋白水平,ELISA测定HUVECs上清液中VEGF-A的浓度;4、过表达C666-1、SUNE1的FBXW7或沉默HIF-1α,分离提取其EVs与HUVECs共培养后;qRT-PCR检测HUVECs中FBXW7、HIF-1αm RNA的表达水平,Western Blot检测HIF-1α的蛋白水平,ELISA测定HUVECs上清液中VEGF-A的浓度;5、下调C666-1、SUNE1中的miR-144后,然后提取分离EVs与沉默FBXW7的HUVECs共培养;Western Blot检测HUVECs的FBXW7、HIF-1α、VEGF-A的蛋白水平,Transwell小室实验检测HUVECs的迁移和侵袭,并进行体外血管生成实验及体内基质胶塞实验。研究结果:1、miR-144在鼻咽癌组织和细胞中上调,并与CD31的表达呈正相关;2、miR-144在鼻咽癌细胞释放的外泌体中高度富集;3、鼻咽癌细胞来源的外泌体miR-144可以增强HUVECs的迁移、侵袭及血管生成;4、鼻咽癌细胞外泌体miR-144通过FBXW7/HIF-1α/VEGF-A轴促进血管生成。结论:miR-144可以通过鼻咽癌细胞分泌的外泌体转运至HUVECs,并增强其迁移、侵袭及血管生成。这为开发基于外泌体的鼻咽癌生物标志物和治疗提供了一个新靶点。