植物源乳酸菌的筛选及其在红枣汁发酵中代谢产物的研究

来源 :石河子大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:honeywell88
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红枣是新疆的第一大果树树种,也是当地的农业支柱产业之一。红枣具有良好的风味与营养,富含果糖和葡萄糖,可以作为乳酸菌发酵的合适基质,但其缺乏专用的乳酸菌发酵剂。因此,为筛选适合红枣发酵的植物源乳酸菌,本研究首先采用宏基因组策略,分别在门、属和种水平上揭示了我国传统植物基发酵食品——鲊辣椒的细菌多样性及乳酸菌的组成。随后运用纯培养技术对鲊辣椒中的乳酸菌进行分离与鉴定,并从耐受性与感官品质两个维度筛选出一株具有优良红枣汁发酵特性的乳酸菌菌株。最后采用非靶向代谢组学技术对该菌株发酵红枣汁过程中挥发性与非挥发性代谢物的动态变化进行监测。本文的主要研究内容与结论如下:(1)Illumina Mi Seq第二代测序与Pac Bio SMRT第三代测序结果表明:鲊辣椒中的优势细菌属是乳酸杆菌属(Lactobacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、片球菌属(Pediococcus)、魏斯氏菌属(Weissella)等,而优势细菌种则是食品乳杆菌(Lactobacillus alimentarius,18.91%)、醋酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans,12.67%)和布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri,7.81%)等。虽然不同地区以及不同原料制备的鲊辣椒之间的细菌群落结构具有显著差异(p<0.05),但乳酸菌在所有鲊辣椒中均占主导地位(平均相对丰度超过70%),并且Lactobacillus alimentarius、Lactobacillus buchneri、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)等可在食品中应用的乳酸菌菌种的累计相对丰度达到了34%以上,表明鲊辣椒是食品领域乳酸菌的良好分离源。(2)采用传统培养分离方法和分子生物学技术在143份鲊辣椒样品中共分离出413株乳酸菌,鉴定为36个乳酸菌种。Lactobacillus plantarum、Lactobacillus alimentarius与Lactobacillus brevis的分离株数量最多,其中Lactobacillus plantarum(108株)是鲊辣椒中的最优势、且能在食品生产中使用的菌种。另外,可培养乳酸菌多样性分析表明,鲊辣椒中乳酸菌分离株多样性和丰富度主要受到发酵环境的影响,而不是原料;发酵环境与原料均会影响鲊辣椒中乳酸菌组成,进而导致不同地区与不同原料制备的鲊辣椒在乳酸菌菌群结构与品质上的差异。(3)通过智能仿生感官系统结合菌株耐受性评价发现:不同Lactobacillus plantarum菌株的耐受性差异主要体现在耐糖性,不同Lactobacillus plantarum菌株发酵在色泽方面主要影响红枣汁的明度、黄蓝度,在气味方面主要影响甲烷、乙醇、氮氧化合物与硫化物的含量,而在滋味方面则主要影响红枣汁的基础滋味。基于多元统计分析结合感官鉴评筛选出了一株Lactobacillus plantarum——LP44:它在p H 2.0、0.5%胆盐与30%葡萄糖的条件下均能存活,并且可以利用包括葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖在内的22种碳源,适用于红枣汁发酵,其发酵的红枣汁不仅色泽为明亮的黄色、富含芳香类化合物、酸味与鲜美味突出,还最大限度降低了硫化物、苦味、涩味及其回味等缺陷型指标对于红枣汁风味的影响。(4)对LP44发酵红枣汁的过程进行监测发现:在发酵40 h时,红枣汁抗氧化活性及乳酸菌活菌数(9.43 log10 CFU/m L)均为最高。利用气相色谱质谱联用仪从红枣汁样本中共检测出以碳水化合物(16种)、酸类(39种)、醇类(11种)和酯类(4种)为主的117种挥发性代谢物。根据挥发性代谢物特征的动态变化,红枣汁的乳酸菌发酵过程可以被划分为发酵前期(0 h~36 h)与发酵后期(40 h~48 h),其中36 h~40 h之间是挥发性代谢物变化关键点。碳水化合物、芳香类和醛类代谢物在发酵前期的红枣汁中显著富集(p<0.05),而酸类、酯类、酚类、萜烯类代谢物在发酵后期的红枣汁中显著富集(p<0.05)。发酵过程中,LP44通过芳香类物质降解途径将联苯降解为苯甲酸,并与LP44的异型发酵产物——乙醇发生酯化反应生成了具有薄荷、蜂蜜与水果香气的关键酯类代谢物——苯甲酸乙酯。LP44可发酵代谢产生D-海藻糖、L-(+)-乳酸、琥珀酸、D-甘露醇、2,3-丁二醇、丙三醇、辛酸乙酯与苯甲酸乙酯等丰富的挥发性代谢物,不仅降低了红枣中的糖含量,还提升了红枣汁的风味、功能性、安全性与抗氧化活性,使其更适合日常摄入。(5)应用超高效液相色谱复合四极杆-轨道阱质谱仪从LP44发酵红枣汁过程中检测出596种非挥发性代谢物。根据非挥发性代谢物特征的动态变化,可将乳酸菌红枣汁发酵过程划分为发酵前期(0 h~16 h)与发酵后期(20 h~48 h),其中16 h~20 h是非挥发性代谢物变化关键点。LP44发酵不仅可以很好地保持红枣中环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷与多酚的稳定性,还可以代谢产生苯丙酸类、香豆素类及其衍生物、醛赖氨酸、n-乳酰-亮氨酸、6-羟基褪黑素与萘啶酸等丰富的非挥发性代谢物,从而提升红枣汁风味以及药用、抗菌和抗氧化活性。此外,LP44还具有一定的降解脂类和类脂分子能力,从而通过发酵间接地提升红枣汁的功能性。KEGG代谢途径分析结果显示,LP44主要通过D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢以及泛酸和Co A生物合成来影响红枣汁中的非挥发性代谢特征。
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