皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,CSCC)是一种起源于表皮或附属器角质形成细胞的皮肤恶性肿瘤,它与中医古文献记载的“翻花疮”、“赘瘤”类似。在皮肤非黑色素细胞瘤中,CSCC的发生率仅次于基底细胞癌(basal cell carcinoma,BCC),同时它也是皮肤非黑色素细胞瘤的首要致死原因。梅奥诊所研究显示,1976年-1984年以及2000年-2010年期间,皮肤鳞癌发病率增加了 263%。随着人口老龄化,该比率很有可能增加。CSCC好发于皮肤暴露部位,如头颈部、上肢伸侧及手背等部位,临床表现以丘疹、结节、溃疡为主。约5%的患者发生淋巴结转移,甚至内脏转移。CSCC的治疗方法包括外科手术治疗、放射线疗法、光动力疗法、化学疗法、局部外用药、CO2激光、冷冻及声动力疗法等。目前,其主要治疗方法是手术切除。但是,较大的肿瘤和广泛的切除术会严重影响患者的生活质量。Mohs显微切除术耗时长、费用高、要求操作者具有较高的专业技术。传统的化疗药物会降低敏感性,并具有皮肤红斑、糜烂、溃疡等副作用。临床观察显示,疣状皮肤鳞癌放疗后会增加转移风险。而激光、冷冻疗法存在较高的复发风险,已逐渐被其他治疗方法所取代。光动力疗法的疗效很难与其他方法相比。因此,基于上升的CSCC发病率以及现有治疗方法的不足,我们有必要开发新的皮肤鳞癌治疗药物,为其治疗提供新思路。中医药在肿瘤的辅助治疗中起到重要作用,历代医家对肿瘤的病因病机进行了归纳,认为主要病机为六淫外袭、情志内伤、痰浊凝聚、瘀血阻滞、正气亏虚,而瘀血阻滞及正气亏虚贯穿疾病始终,因而治则离不开以活血化瘀与扶助正气。人体气血周流不止,若气虚邪凑,瘀血阻滞,诱正为邪,则聚集形成癌瘤。瘀血是肿瘤基本病理产物,活血化瘀法则是治疗肿瘤的基本方法。银杏叶性味甘、苦、涩、平;归心、肺经;功效活血化瘀,通络止痛。多个实验已报道银杏叶提取物(ginkgo biloba extract,EGb)具有抗肿瘤作用。现代药理学研究表明,EGb的主要成分是类黄酮及萜类化合物(银杏内酯和双叶类化合物),其抗癌特性为抗氧化、抗血管生成和基因调节作用。含类黄酮的饮料或食物可以降低罹患各种癌症(包括前列腺癌、肺癌、胃癌和乳腺癌)的风险。体外实验表明,EGb761可以抑制多种肿瘤细胞的增殖和凋亡。扶正即扶助正气,扶正多用补虚之法,扶正与祛邪相互为用、相辅相成。金代医家张元素、李东垣等提出“养正积自消”的著名治法。刘嘉湘教授提出“无虚不成瘤”,力推扶正法治疗肿瘤。研究表明胶原肽具有抗氧化、免疫调节以及抗肿瘤作用。徐晓冰等发现EGb与阿胶水解物结合可抑制乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的增殖。另外,多项研究表明胶原肽对HaCaT细胞具有保护作用。张旭等提取了林蛙皮肤肽的酸和酶提取物,发现它能够促进HaCaT细胞的增殖;而在UVB刺激下,该肽抑制了 HaCaT细胞的凋亡。研究目的:目前尚无银杏叶与胶原肽单独或联合使用治疗皮肤鳞状细胞癌的相关研究,本研究将结合中医活血化瘀与扶正二法,探究银杏叶提取物联合胶原肽对皮肤鳞癌A431细胞增殖、凋亡的作用及其机制。研究方法:通过3-(4,5-二甲基2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-溴化四唑(MTT)法检测银杏叶、银杏叶联合胶原肽对A431细胞、HaCaT细胞增殖活性的影响;以流式细胞仪检测银杏叶、银杏叶联合胶原肽对A431细胞凋亡率的影响;以Hoechst33258荧光染色法观察银杏叶、银杏叶联合胶原肽对A431细胞凋亡形态的影响;以Western Blot法测定Fas、Bcl-2、BAX蛋白表达水平的变化。研究结果:MTT测定表明,EGb抑制A431细胞和HaCaT细胞的增殖;胶原肽对HaCaT细胞的增殖具有双向作用;联合物(银杏叶联合胶原肽)可以增强EGb对A431细胞的增殖抑制作用,并可以减弱EGb对HaCaT细胞的杀伤作用。流式细胞仪分析显示,联合物能够增加EGb对A431细胞的凋亡率;使用Hoechst 33258法对A431细胞进行荧光染色,在荧光显微镜下能够观察到联合物处理的A431细胞较EGb具有更多的凋亡形态特征,包括细胞数量的减少,以及观察到强烈染色的细胞核、凋亡小体、碎片细胞核。Western Blot分析表明,联合物较EGb增加Fas的表达,并上调了 BAX和Bcl-2的相对比例。结论与意义:联合物(银杏叶联合胶原肽)能够增强EGb对A431细胞的增殖抑制作用,并且可以减轻EGb对HaCaT细胞的增殖抑制。联合物还能够增强EGb对A431细胞的促凋亡作用,其机制与内源性及外源性凋亡途径相关。本研究对今后治疗皮肤鳞状细胞癌的新药开发具有一定意义。