研究背景放射治疗（Radiotherapy,RT）是目前乳腺肿瘤常用的临床治疗手段。由于在肿瘤治疗时会出现放射抗性以及全身性不良反应,而使RT治疗功效极大地降低。因此,寻找安全而有效的放射增敏剂,既能增加RT敏感性,还能有效地避免RT治疗过程中产生的全身性不良反应,已然成为目前肿瘤放射治疗领域的一项重大课题。2-己基-4-戊炔酸（2-hexyl-4-pentynoic acid,HPTA）是抗癫痫病药物丙戊酸（Valproate,VPA）的衍生物,属于VPA类化合物,是组蛋白去乙酰化酶抑制剂（Histone deacetylase inhibitor,HDACi）。HPTA 抑制 HDAC 活性的 IC50比VPA（348-448μM）低很多,仅为11-15μM,提示着HPTA可能是更加高效的VPA替代物。我们课题组最新研究表明VPA对乳腺肿瘤组织细胞具有放射增敏作用,并发现VPA能靶向泛素连接酶RFWD3促进重组酶Rad51泛素化,降低 Rad51 蛋白表达,抑制 DNA 双链断裂（DNA double strand breaks,DSBs）损伤修复的同源重组（Homologous recombination,HR）机制,实现对肿瘤细胞的放射增敏作用。但是HPTA是否也具有对肿瘤细胞放射增敏作用、其可能的增敏机制以及能否替代VPA成为更安全高效的增敏剂等等,目前均未见报道。DNA DSBs损伤的修复机制主要包括HR和非同源末端连接（NHEJ）,其中HR是一种准确无误的DNA损伤修复形式,因而备受关注。Rad51是HR修复的关键酶,它的功能状态可直接影响DNA损伤修复以及基因组的稳定性。目前已报道,在DNA损伤修复过程中,Rad51表达水平不但受泛素连接酶RFWD3的调控,而且还受去泛素化酶（deubiquitinating enzymes,DUBs）的影响,泛素连接酶和去泛素化酶二者协同调控Rad51的水平,从而维持其处于稳定状态,以适应机体的功能需要。有研究报道,去泛素化酶家族成员UCHL3能够直接去泛素化修饰Rad51,促进BRCA2-Rad51结合及Rad51的募集,继而参与DNA损伤修复过程。由此提示UCHL3-Rad51通路所调控的HR机制在维持细胞功能状态方面同样具有重要的作用。但是,HPTA能否靶向作用于UCHL3-Rad51去泛素化通路以影响IR对肿瘤组织的杀伤作用,目前也未见报道。值得注意的是,放疗还可引起肿瘤免疫耐受,导致肿瘤的进展与复发,进而影响肿瘤放射治疗的敏感性,所以如何逆转放疗引起的肿瘤免疫耐受或者激活机体的抗肿瘤免疫反应以增加肿瘤细胞对放射的敏感性,也是该研究领域亟待突破的瓶颈。近年来有研究证明,HDACi能通过增加肿瘤免疫原性分子的表达以达到抑制肿瘤的作用,VPA通过抑制HDACs可以降低免疫逃逸以抑制肿瘤细胞的生长。那么HPTA是否能通过激活机体的抗肿瘤免疫反应而逆转放疗引起的肿瘤免疫耐受尚不清楚。综上所述,本课题提出如下假说:相较于VPA,HPTA可能是一种更高效且安全的放射增敏剂;它可能靶向作用于UCHL3-Rad51去泛素化通路调控HR修复机制,增加肿瘤细胞对IR的敏感性,达到显著的抗肿瘤功效;同时,HPTA还可能逆转肿瘤免疫逃逸,通过激活抗肿瘤免疫应答机制增强对肿瘤细胞的放射增敏作用。本研究目的在于发现能抑制DNA损伤修复及激活抗肿瘤免疫应答的多靶点的放射增敏制剂,为HPTA应用于临床肿瘤RT治疗提供可靠的理论与实验依据。第一章节 HPTA对乳腺肿瘤的放射增敏效应的研究研究目的:以VPA作为阳性对照,通过乳腺癌细胞系、本课题组建立的环境致癌物（DMBA）诱导的MCF10A正常乳腺上皮细胞的恶性转化细胞（MCF10A-DMBA）及原发性大鼠乳腺癌动物模型,在细胞与动物水平上系统地探讨低浓度HPTA对肿瘤组织细胞的放射增敏效应,同时还研究HPTA对IR诱导的正常组织细胞损伤的影响。研究方法:1.HPTA对乳腺肿瘤细胞的放射敏感性影响的检测应用乳腺癌细胞系MCF7以及MCF10A-DMBA细胞,首先确定HPTA处理细胞剂量。处理后的细胞,通过MTT实验、细胞克隆实验分别研究HPTA的放射增敏效果、作用浓度及细胞存活情况。2.HPTA对原发性大鼠乳腺癌放射敏感性影响的检测应用课题组建立的原发性大鼠乳腺癌动物模型,首先确定HPTA处理动物的剂量以及HPTA与IR联合处理动物的方式。处理后10天,分别进行以下检测:测量记录其肿瘤大小变化、HE染色观察肿瘤病理形态变化、免疫组织化学实验检测肿瘤组织内含增殖标志物BrdU及Ki67的细胞数量及凋亡标志物Cleaved caspase-3的表达情况、免疫组织荧光检测血管内皮细胞表面标志物CD31在组织血管中的表达。3.HPTA对IR诱导的正常组织细胞损伤影响的检测处理后的正常乳腺细胞MCF10A,通过细胞克隆实验检测细胞存活情况。处理后的原发性肿瘤动物,比较分析大鼠体重变化及主要器官（脾脏、肝脏、肺脏及大脑）的脏器指数变化以及BrdU免疫组织化学染色比较脾脏和小肠组织中增殖细胞的数量。研究结果:1.低剂量HPTA对乳腺肿瘤细胞的放射敏感性影响首先确定HPTA的放射增敏剂量为15μM。研究发现:15μM HPTA与IR联合可显著抑制MCF7细胞生长,和500μM VPA与IR联合的作用相似;15μM HPTA可有效增加MCF7和MCF10A-DMBA细胞对IR的敏感性,降低细胞的存活。2.HPTA对原发性大鼠乳腺癌放射敏感性影响首先确定采用分次小剂量IR（2Gy/次/天,连续4天）进行原位肿瘤照射,以及选择20mg/kg HPTA处理DMBA诱导的原发性乳腺肿瘤大鼠,其联合方式是在IR处理的全程都给予HPTA处理。研究发现:联合处理组较单独IR组肿瘤减小的更加明显;联合处理组的肿瘤组织内可见更多更大的空泡状坏死结构;联合处理后肿瘤组织中表达细胞增殖标志物BrdU和Ki67的细胞数量显著减少,但肿瘤组织中表达凋亡标志物Cleaved caspase-3阳性细胞数明显增多;肿瘤组织内表达血管内皮细胞表面标志物CD31阳性区域（血管的密度）显著减少,提示肿瘤组织细胞增殖能力降低、细胞凋亡增加以及血管生长被抑制。3.HPTA对IR诱导的正常组织细胞损伤的影响在细胞水平上,15μM HPTA没有显示对正常细胞MCF10A的放射增敏作用。在动物模型中,肿瘤原位IR可导致动物体重显著下降,但20mg/kg HPTA能明显地将体重恢复至正常水平,肝脏和脾脏的脏器指数得到恢复,脾脏和小肠中有增殖能力的细胞数量也显著增加。研究结论:1.HPTA是一种高效的肿瘤组织细胞放射增敏剂:应用乳腺癌细胞模型,发现15μM HPTA能够发挥对肿瘤细胞的放射增敏作用;应用原发性乳腺肿瘤模型,发现20mg/kg HPTA能够发挥对肿瘤组织的放射增敏作用。2.HPTA是一种安全的放射增敏剂:HPTA在发挥对肿瘤细胞放射增敏作用同时,还能减轻IR诱导的正常组织细胞的毒性损伤作用。第二章节 HPTA通过靶向调控UCHL3-Rad51同源重组修复通路参与其对乳腺肿瘤的放射增敏作用研究目的:通过第一章节研究,应用多种乳腺癌细胞系模型及原发性大鼠乳腺癌动物模型,发现低浓度HPTA具有和高浓度VPA相似的对肿瘤组织细胞的放射增敏效应,提示IR诱导的DNA DSBs修复机制HR和NHEJ可能参与HPTA对肿瘤细胞的放射增敏作用。本章节将继续应用上述研究模型对HPTA的放射增敏作用机制进行深入地探讨。研究方法:1.HPTA对IR诱导的乳腺肿瘤细胞内DNA DSBs影响的检测应用乳腺癌细胞系MCF7以及MCF10A-DMBA细胞,通过中性及碱性彗星实验、细胞免疫荧光实验以及Western blotting分别研究细胞双链断裂损伤情况、DSBs损伤标志物γH2AX与53BP1焦点形成以及蛋白表达。应用原发性乳腺肿瘤模型,通过Western blotting实验检测肿瘤组织中YH2AX蛋白表达。对肿瘤组织来源的原代培养细胞,通过细胞免疫荧光实验以及Western blotting分别研究细胞γH2AX与53BP1焦点形成以及蛋白表达。2.HPTA对IR诱导的DNA DSBs的HR修复功能影响的检测应用稳定表达同源重组底物pDR-GFP的MCF7细胞,转染I-SceI核酸酶以造成细胞内DNA双链断裂,采用流式细胞技术检测含GFP表达的细胞,以评估HR修复效率;流式细胞技术检测处理后MCF7细胞的细胞周期变化;通过细胞免疫荧光实验、Western blotting及实时荧光定量PCR分别检测HR关键修复蛋白Rad51与BRCA1的焦点形成、蛋白表达水平以及mRNA表达等;通过BRCA1的缺欠和被Rad51抑制剂所干预的细胞,检测处理后细胞的克隆形成能力。3.HPTA对IR诱导的DNA DSBs的NHEJ修复功能影响的检测应用稳定表达非同源末端连接底物EJ5-GFP的U2OS细胞,转染I-SceI核酸酶以造成细胞内DNA双链断裂,采用流式细胞技术检测含GFP表达的细胞,以评估NHEJ修复效率;Western blotting检测NHEJ关键修复蛋白DNA-PKcs、Ku70及Ku80蛋白水平。4.HPTA对Rad51稳定性及泛素化影响的检测Western blotting检测放线菌酮处理后细胞BRCA1与Rad51蛋白半衰期的变化;Western blotting检测MG132处理后Rad51蛋白水平变化;免疫共沉淀实验检测Rad51蛋白泛素化变化。5.HPTA对UCHL3-Rad51介导的去泛素化通路影响的检测Western blotting检测UCHL3蛋白水平变化;免疫共沉淀实验检测UCHL3与Rad51的相互作用;UCHL3的siRNA下调其表达后,Western blotting检测细胞Rad51蛋白水平的变化以及免疫共沉淀实验检测Rad51蛋白泛素化变化。6.HPTA对原发性大鼠乳腺癌放射增敏机制的检测免疫组织化学和Western blotting实验检测Rad51蛋白表达情况;Western b1otting实验检测UCHL3蛋白水平变化。研究结果:1.HPTA对IR诱导的乳腺肿瘤细胞内DNA DSBs的影响在细胞水平上,HPTA加重了 IR诱导的MCF7细胞DSBs损伤;在MCF7以及MCF10A-DMBA细胞中,HPTA显著增加了 IR诱导的γH2AX与53BP1焦点形成以及蛋白表达水平。在动物水平上,通过原发性大鼠乳腺肿瘤模型,联合组肿瘤组织中的γH2AX蛋白表达较单独IR组显著增加。通过对肿瘤组织进行细胞原代培养,发现在联合处理后细胞中的γH2AX与53BP1焦点形成较单独IR组显著增加。2.HPTA对DNA DSBs的HR修复功能的影响15μM HPTA显著降低了42.88%的细胞HR效率,而且HPTA对细胞周期没有影响;与单独IR组相比,15μMHPTA显著降低了 MCF7和MCF10A-DMBA两种细胞的Rad51与BRCA1的焦点形成和蛋白水平。BRCA1缺欠和Rad51的下调均使HPTA放射增敏作用显著降低。3.HPTA对DNA DSBs的NHEJ修复功能的影响15μM HPTA显著降低了19.48%的细胞NHEJ效率,但HPTA对NHEJ修复主要相关蛋白,DNA-PKcs、Ku70和Ku80,均无明显影响。4.HPTA诱导的放射增敏作用与Rad51蛋白稳定性及蛋白泛素化之间的关系放线菌酮处理MCF7细胞后,HPTA与IR联合能显著缩短了 BRCA1与Rad51的蛋白半衰期;MG132处理MCF7细胞后,能逆转HPTA与IR联合所致的Rad51水平的降低;免疫共沉淀实验结果进一步显示HPTA与IR联合显著增加了 Rad51蛋白泛素化水平。5.HPTA诱导的肿瘤细胞放射增敏作用与UCHL3-Rad51去泛素化通路之间关系在细胞水平上,HPTA与IR联合能显著抑制UCHL3蛋白水平;UCHL3与Rad51两种蛋白之间存在相互作用;应用UCHL3的siRNA下调其在MCF7细胞内表达后,HPTA与IR联合所致的Rad51蛋白表达水平下降被逆转。在动物水平上,通过原发性大鼠乳腺肿瘤模型,相较于单独IR组,HPTA与IR联合处理使肿瘤组织的Rad51及UCHL3蛋白表达水平均显著降低;HPTA与IR联合使肿瘤组织内表达Rad51细胞数较单独IR明显减少。研究结论:通过乳腺肿瘤细胞和大鼠原发性乳腺肿瘤模型,在细胞和动物水平上发现HPTA能增加IR诱导的DNA DSBs的蓄积,靶向去泛素化酶UCHL3调控Rad51蛋白泛素化水平,抑制Rad51功能,下调Rad51-HR修复通路,发挥对肿瘤组织细胞的放射增敏作用。第三章节HPTA通过激活的抗肿瘤免疫反应参与其对肿瘤组织细胞放射增敏作用研究目的:通过前面两章节研究,在细胞及动物水平上证明了 HPTA是个高效安全的肿瘤组织细胞的放疗增敏剂,能靶向调节肿瘤细胞内UCHL3-Rad51去泛素化通路发挥放射增敏作用。近年来,放疗引起的肿瘤免疫耐受所致的肿瘤进展与复发也越来越引起人们的关注,HPTA对RT效果的增强是否与其对免疫功能的调控有关,目前也尚不清楚。因此,在这章节研究中,应用DMBA诱导的原发性乳腺癌以及细胞共培养研究模型,在动物和细胞水平上探讨HPTA是否能激活免疫细胞（巨噬细胞以及细胞毒性CD8+T细胞）所依赖的抗肿瘤免疫功能,发挥其对肿瘤组织细胞的放射增敏作用。研究方法:1.HPTA的抗肿瘤免疫功能激活与巨噬细胞极化之间关系的检测应用原发性大鼠乳腺癌动物模型,处理后10天的肿瘤组织样本:免疫组织化学实验检测巨噬细胞标志物F4/80及CD68在各处理组的阳性表达情况;实时荧光定量PCR检测肿瘤组织中巨噬细胞分型标志物及其分泌的相关细胞因子。免疫组织化学及免疫组织荧光实验鉴定巨噬细胞来源及其吞噬能力。在细胞水平上,用培养MCF7的条件培养基处理巨噬细胞以检测HPTA对巨噬细胞极化的影响,通过实时荧光定量PCR及ELISA检测巨噬细胞分型标志物及其分泌的相关细胞因子;MTT实验检测HPTA处理的巨噬细胞裂解液对受照MCF7肿瘤细胞生长的影响。2.HPTA的抗肿瘤免疫激活与CD8+T细胞之间关系的检测应用原发性大鼠乳腺癌模型,处理后10天的肿瘤组织样本:免疫组织化学实验检测CD8+T细胞及颗粒酶B在各处理组的阳性表达情况。在细胞水平上,用HPTA处理后的巨噬细胞RAW264.7的细胞裂解液作用于已激活的健康人外周血中的单个核细胞（PBMCs）,通过流式细胞术检测CD8+T细胞数量变化;进一步用含有已活化的CD8+T细胞的PBMCs与受照MCF7细胞共培养,通过MTT实验检测对受照肿瘤细胞生长的影响。3.HPTA抗肿瘤免疫反应持久功效的检测应用原发性大鼠乳腺癌动物模型,处理后70天,分别进行以下检测:测量记录其肿瘤大小变化、HE染色观察肿瘤病理形态变化;通过免疫组织化学实验;应用细胞增殖能力指标BrdU及Ki67,检测肿瘤组织细胞的增殖情况;通过免疫组织化学、实时荧光定量PCR及免疫组织荧光实验检测巨噬细胞极化与活化的CD8+T细胞;通过免疫荧光实验检测肿瘤组织中表达血管内皮细胞标志物CD31血管的密度变化。研究结果:1.HPTA激活M1型巨噬细胞介导的抗肿瘤免疫反应对肿瘤组织细胞放射增敏作用的影响在动物水平上,HPTA与IR联合处理后肿瘤组织内表达巨噬细胞标志物F4/80及CD68细胞数量较单独IR组明显增加,其中表达M1型巨噬细胞标志物（CD86和MHC-II）及其分泌的相关细胞因子（IFN-γ、IL-12、IL-6和TNF-α）明显增加,但M2型巨噬细胞标志物（CD209和CD163）及其分泌的细胞因子（IL-10）明显减少,表明HPTA放射增敏作用可能与M1巨噬细胞浸润有关,提示着HPTA可能促进了巨噬细胞的重编程;HPTA联合IR处理后肿瘤组织内表达髓系分化细胞的标志物CD11b阳性细胞数明显增多、乳腺肿瘤细胞的标志物EpCAM和F4/80具有较好的免疫荧光共定位,深入揭示浸润的巨噬细胞来自髓系并具有强的吞噬作用。在细胞水平上,用培养过肿瘤细胞的条件培养基处理巨噬细胞RAW264.7后,发现HPTA可诱导其向M1型极化,表现为M1型巨噬细胞标志物及其分泌的以IFN-γ和IL-12为主的细胞因子增加以及M2型巨噬细胞标志物及其分泌的以IL-10为主的细胞因子减少,这与动物实验结果相一致。在此基础上,用HPTA激活的M1型巨噬细胞的细胞裂解液处理受照射的MCF7细胞,研究结果表明受照肿瘤细胞的生长被进一步抑制,由此提示M1型巨噬细胞抗肿瘤免疫通路可能参与了 HPTA对肿瘤组织细胞放射增敏作用。2.HPTA激活巨噬细胞-CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫通路对肿瘤组织细胞的放射增敏作用的影响在动物水平上,HPTA联合IR处理后肿瘤组织内表达CD8+T细胞数量显著增加,表达CD8+T细胞的活化标志物颗粒酶B细胞数量也明显增加,提示HPTA放射增敏作用可能与活化的CD8+T细胞在肿瘤组织内浸润有关。在细胞水平上,用HPTA激活的M1型巨噬细胞的细胞裂解液作用于PBMCs,流式结果显示PBMCs中CD8+T细胞数量变化明显增加,提示HPTA能通过激活的巨噬细胞活化CD8+T细胞。在此基础上,用含已活化的CD8+T细胞的PBMCs与受照MCF7细胞进行共培养,研究结果发现受照肿瘤细胞的生长也受到明显抑制,由此提示M1型巨噬细胞-CD8+T细胞抗肿瘤免疫通路可能参与了 HPTA对肿瘤组织细胞放射增敏作用。3.HPTA激活的免疫细胞介导的抗肿瘤免疫功能存在的持久性研究在动物水平上,在处理后70天,HPTA与IR联合组仍显著抑制肿瘤生长、肿瘤组织内存在大量坏死区域、肿瘤细胞增殖能力显著降低、肿瘤组织中的血管密度明显稀疏、大量M1型活化的巨噬细胞和CD8+T细胞在肿瘤组织内浸润。上述结果提示HPTA激活的免疫细胞介导的免疫反应能够持久存在,并维持其较强抗肿瘤功效。研究结论:1.HPTA是有效的免疫激活剂:HPTA不但能激活M1型巨噬细胞介导的抗肿瘤免疫通路,还能激活巨噬细胞-CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫通路,它们都参与了 HPTA对肿瘤组织细胞的放射增敏作用。2.HPTA激活的免疫细胞介导的免疫功可持续存在,并能维持较强的抗肿瘤免疫功效。