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胶质瘤是最常见的中枢神经系统的肿瘤,根据其组织病理学的特点,世界卫生组织将其恶性程度从低到高划分为Ⅰ-Ⅳ级,其中Ⅳ级胶质瘤的恶性程度最高,又被称为胶质母细胞瘤（Glioblastoma Multiforme,GBM）。成人胶质母细胞瘤大约占所有胶质瘤的56.6%,占所有中枢神经系统恶性肿瘤的48%,是最具致死性的恶性肿瘤之一,5年的平均生存率仅接近5%。它给临床治疗工作带来了巨大挑战。目前胶质母细胞瘤初始标准治疗主要通过三种治疗方式进行:最大范围的在保证患者安全前提下进行手术切除、同步进行的放疗和化疗。然而,由于肿瘤不受限制的弥漫性和浸袭性生长方式,临床上完全切除肿瘤非常困难。术后对于可能的肿瘤残留,积极采用放疗与替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）同步化疗可提高新诊断GBM患者的中位、2年和5年生存率。然而由于肿瘤细胞对TMZ固有或治疗诱导的耐药,整体临床疗效令人失望,胶质母细胞瘤仍然不可避免地复发。研究表明TMZ治疗效应不是由单个分子或通路介导的,而是由多个分子或信号通路参与。CUL4B属于Cullin家族,作为支架蛋白参与组成Cullin 4B-RING E3泛素连接酶复合物（Cullin 4B RINGE3 ligase,CRL4B）。CRL4B可通过泛素化特异性的底物促使其蛋白酶体依赖的降解,也可以将组蛋白作为底物进行泛素化,进而通过多种机制调控组蛋白的甲基化、乙酰化和DNA的甲基化来发挥表观遗传调控的作用。CRL4B可广泛参与到多种生理过程中,包括调节细胞周期、细胞信号转导、调控基因转录和参与个体生长发育等重要的生命活动。CUL4B的功能异常与多种疾病的相关。一方面,CUL4B基因的功能丧失突变可导致X连锁精神发育迟滞综合征;另一方面,CUL4B已被证实在多种不同组织来源的实体肿瘤中表达显著增加,并通过调节包括细胞周期、表观调控等机制,抑制多种抑癌基因转录,使其发挥癌基因作用。值得指出的是,CUL4B还可以通过调控髓源抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）的累积与活化而发挥抑癌基因作用。因此,在肿瘤的发生发展方面,CUL4B发挥非常重要作用。尽管之前有研究表明,CUL4B在促进胶质瘤细胞增殖和迁移能力方面发挥作用,但是其表达水平与胶质瘤预后的关系、尤其是胶质瘤对TMZ治疗效应方面的作用尚无研究。因此,本课题探讨了 CUL4B在胶质瘤TMZ治疗效应的作用及机制,取得了以下结果:第一部分CUL4B在胶质瘤中高表达且与患者的不良预后相关通过Western Blot方法,我们对收集的29对胶质瘤肿瘤组织和瘤旁非肿瘤组织标本进行分析。结果显示,CUL4B在胶质瘤中高表达,并且其表达水平随肿瘤级别升高而明显增加。我们进一步对TCGA、Rembrandt、GEO、CGGA等公共数据库中CUL4B mRNA表达进行分析。结果显示,胶质瘤中CUL4B的表达水平较非肿瘤组织显著增加,并且随着肿瘤恶性程度的增加,CUL4B的表达也上调。在胶质瘤患者中,CUL4B表达与预后不良呈正相关。我们还发现在接受TMZ治疗的GBM患者中,CUL4B高表达患者的总体生存期显著低于CUL4B低表达的患者。与原发的胶质瘤相比,CUL4B在复发的胶质瘤中表达显著上调。GBM分子亚型的分析结果显示,CUL4B在间充质亚型的GBM中表达显著升高。GBM亚解剖定位的分析结果显示,CUL4B在GBM微血管增殖区高表达。对影响胶质瘤TMZ药物治疗效应的分子标志物分析显示,CUL4B的表达不受O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT）启动子甲基化状态影响。第二部分CUL4B降低胶质瘤细胞对TMZ的敏感性我们进一步利用细胞和动物模型分析了 CUL4B表达对胶质瘤TMZ敏感性的影响。首先,Western Blot实验证实,TMZ处理可诱导胶质瘤细胞CUL4B的表达上调。在对6种胶质瘤细胞的蛋白表达分析结果显示,在TMZ敏感的胶质瘤细胞中,CUL4B低表达,而在TMZ抵抗的胶质瘤细胞中CUL4B高表达,CUL4B表达水平与胶质瘤细胞TMZ敏感性呈负相关。生物信息学分析公共数据库中17种胶质瘤细胞中CUL4B的表达分析也证实以上结论。为进一步分析CUL4B表达对胶质瘤TMZ敏感性的影响,我们在胶质瘤细胞中敲低或过表达CUL4B,利用CCK-8和克隆形成实验分析了改变CUL4B表达对胶质瘤细胞TMZ敏感性的影响。结果发现敲低CUL4B增加胶质瘤细胞对TMZ的敏感性,而过表达CUL4B降低胶质瘤细胞对TMZ的敏感性。小鼠荷瘤实验结果显示,敲低CUL4B显著提高TMZ治疗效果。第三部分CUL4B影响胶质瘤细胞TMZ敏感性的机制研究我们进一步探究了 CUL4B调控胶质瘤细胞TMZ敏感性的分子机制。衰老相关β-Gal染色证明TMZ可诱导胶质瘤细胞衰老。敲低CUL4B可增强TMZ诱导的胶质瘤细胞衰老。细胞周期分析显示,在CUL4B低表达的胶质瘤细胞中,S期阻滞增加。CUL4B过表达则减弱TMZ诱导的胶质瘤细胞衰老。这些结果均提示CUL4B通过抑制衰老促进胶质瘤细胞的TMZ耐药。进一步分析发现,TMZ处理后胶质瘤细胞内p21的蛋白表达上调,而CUL4B低表达细胞内p21蛋白水平较对照细胞升高更为明显。小鼠荷瘤实验结果也显示,TMZ处理后,在CUL4B低表达的胶质瘤细胞中,p21的表达明显增加。而在CUL4B过表达的胶质瘤细胞中转染p21表达质粒可有效恢复TMZ诱导的细胞衰老。这些结果提示CUL4B可通过负调控胶质瘤细胞内p21的蛋白表达抑制TMZ诱导的胶质瘤细胞衰老。实时定量PCR（qRT-PCR）显示CUL4B可在转录水平抑制CDKN1A的表达。TMZ处理后,低表达CUL4B的胶质瘤细胞CDKN1A mRNA的上调更加显著。通过ChIP实验,我们发现CUL4B和HDAC1/3可结合在CDKN1A的启动子。qRT-PCR检测发现,与抑制CUL4B表达类似,HDAC抑制剂也能够促进CDKN1A的转录。这些结果提示CUL4B可能与HDAC1/3共同作用抑制CDKN1A的转录进而抑制TMZ诱导的胶质瘤细胞衰老。综上所述,通过本课题研究得出如下结论:CUL4B在胶质瘤组织中高表达,且其表达水平与肿瘤恶性程度正相关;CUL4B高表达患者生存期较短,TMZ的治疗效应减弱;CUL4B通过抑制TMZ诱导的细胞衰老降低胶质瘤细胞TMZ敏感性;CUL4B能够结合CDKN1A的启动子并协同HDAC复合物抑制CDKN1A转录,降低p21的表达,抑制TMZ诱导的胶质瘤细胞衰老。我们的研究阐明了替莫唑胺获得性耐药的新机制,并且CUL4B可作为胶质瘤临床预后的预测因子和潜在的治疗靶点。