微孢子虫(Microsporidia)是一类细胞内专性寄生的真核生物,在自然界具有广泛的宿主域,数目众多、分布广泛。家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)是微孢子虫属的典型种,它能够引发家蚕微粒子病(Pebrine)。该病即可食下传染,也可由带病母蛾胚种传染,是蚕业生产上的毁灭性病害,因此被所有蚕业生产国列为法定检疫对象。除通过母蛾镜检淘汰带毒蚕种外,目前家蚕微粒子病的防治方法还包括化学防治和物理防治两大类。化学防治方法包括化学药物消毒和化学药物治疗。消毒药物一般具有强腐蚀性,而且对带毒蚕卵中的病原体没有防治效果;治疗药物长期服用对蚕体有一定毒性,影响蚕种质量。已报道的物理防治法主要有温汤浴种法、高温即时浸酸法(高温即浸法)及干热空气处理法。高温即浸法效果明显,操作简单,但之前高温即浸试验以多化性家蚕品种开展的研究,针对二化性蚕品种的高温即浸法条件尚未建立,防治效果有待验证。本研究通过养蚕试验明确了高温高温即浸法对家蚕微粒子病的防治效果,采用吉姆萨染色法观察了蚕种即浸适期病原在蚕卵中的发育形态,利用荧光定量PCR技术检测了高温即浸处理对蚕卵中家蚕微孢子虫的灭活效果,通过高通量测序分析了高温即浸处理后家蚕胚胎和病原的基因表达变化,阐明了高温即浸防治家蚕微粒子病胚种传染的机理,为生产上应用高温即浸防治家蚕微粒子病提供科学依据。取得以下研究成果:⒈对家蚕二化性四元杂交品种两广二号的带毒蚕卵进行高温即浸处理,蚕卵孵化后分别饲养至3龄眠蚕和5龄起蚕用显微镜镜检Nb,发现与常规即浸处理相比,带毒蚕卵经高温即浸处理后家蚕微孢子虫感染率分别为3.55±1.55%和13.10±5.90%,相对防治效果分别是92.30±2.95%和81.80±0.06%。由此可见,高温即浸处理能够有效阻断家蚕微粒子病的胚种垂直传播,对家蚕微粒子病有显著的治疗效果。2.通过吉姆萨染色法对高温浸酸时期(卵龄18~22 h)带毒蚕卵中家蚕微孢子虫的发育状态进行观察,发现带毒蚕卵中的病原为双核、四核裂殖体。浸酸处理48 h后,阳性对照组和常规即浸处理组蚕卵中均仍观察到裂殖体,高温处理组则没有发现病原,推测高温即浸处理的作用有效靶点为家蚕微孢子虫的裂殖体阶段。3.利用荧光定量PCR技术建立了以家蚕微管蛋白Tubulin为靶基因的标准曲线,对卵龄24~240 h阳性对照、常规即浸组和高温即浸组内带毒蚕卵中微孢子虫进行绝对定量分析。结果发现:常规或高温即浸处理后每日取样蚕卵中家蚕微孢子虫的检测值均显著降低,高温即浸组明显低于常规即浸处理,表明两种浸酸处理对蚕卵中的家蚕微孢子虫均有灭活作用,但是高温处理的灭活效果更为显著。根据即浸处理后带毒蚕卵内病原量的变化规律,推测高温即浸处理能够灭活蚕卵内的病原裂殖体,少量未被灭活的成熟孢子则能够继续生长发育。4.对带毒蚕卵分别进行常规即浸处理和高温即浸处理,利用RNA-Seq技术对阳性对照组、常规处理组和高温处理组的蚕卵样本进行高通量测序,并对处理前后的差异表达基因(DEGs)进行GO功能分析和KEGG pathway分析。结果发现,常规处理后家蚕差异表达基因400个,病原差异表达基因38个,高温处理组后家蚕差异表达基因1999个,病原差异表达基因20个。高温即浸处理后家蚕热激蛋白等基因表达显著上调,病原差异表达基因数量较常规处理组明显降低,推测高温即浸处理能够激发蚕卵免疫应答增强对病原的抗性,同时影响家蚕微孢子虫的基础代谢导致病原裂殖体死亡。