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猪不但是重要的农业经济动物,而且基于与人相似的生理学特征、器官发育过程和疾病进程还可以作为人类医学研究中的一种重要模式动物。睾丸组织作为雄性动物的重要生殖器官,其生长发育与精子生成过程息息相关,而由于睾丸发育和精子生成过程涉及到包括支持细胞、间质细胞和生殖细胞在内的多种细胞协同作用而使得该过程受到极其复杂和严格的分子调控。揭示睾丸发育和精子生成过程中潜在的调控基因和信号通路将为我们研究精子生成提供新的线索和产生新的理论假设。本研究以沙子岭猪为研究对象,采用RNA-seq技术对猪睾丸组织发育过程中差异表达的蛋白编码基因和microRNAs(miRNAs)进行鉴定和筛选,并在细胞水平进行功能研究,主要研究结果如下:(1)利用Illumina HiSeq 2500测序平台对60胎龄(E60)、90胎龄(E90)、30日龄(D30)和180日龄(DM)的猪睾丸组织构建cDNA文库并测序,分别获得56296294、49177458、48837300、41545444条Clean reads。差异表达分析分别在E90 vs.E60、D30 vs.E90、DM vs.D30三个组合中鉴定出1007(646上调,361下调),1929(911上调,1018下调)、7420(3998上调,3422下调)个差异表达基因,分别富集于37、20、77个GO(Gene ontology)项和11、23、9条KEGG信号通路。此外,从20398个蛋白编码基因中鉴定出92738个可变剪接事件,且以第一个外显子可变剪切、最后一个外显子可变剪切、单外显子跳跃和可变5′或3′端剪切四种类型为主。(2)利用Illumina HiSeq 2000测序平台对60胎龄(E60)、90胎龄(E90)、30日龄(D30)和180日龄(DM)的猪睾丸组织构建Small RNA文库并测序,分别获得6347414、6287768、6148364、6333541 Clean reads,共计鉴定出304个猪已知miRNAs和50个猪新预测miRNAs。差异表达分析分别在E90 vs.E60、D30 vs.E90、DM vs.D30三个组合中鉴定出93(48上调,45下调),104(49上调,55下调)、122(49上调,73下调)个差异表达miRNAs。通过将差异表达的蛋白编码基因和miRNAs进行关联分析共预测出55339个miRNA-mRNA结合位点,GO功能富集和KEGG通路分析发现这些靶基因主要富集于睾丸发育和精子生成相关的GO项和KEGG信号通路中,例如PI3K-Akt信号通路,Hippo信号通路,以及碳代谢、脂肪代谢、蛋白代谢信号通路等。(3)从miRNA-mRNA关联分析结果中筛选出miR-10和DAZAP1、KLF11基因与miR-26a和ULK2基因做进一步验证。利用实时荧光定量PCR技术检测了mi R-10b、miR-26a、DAZAP1、KLF11、ULK2基因在1日龄、30日龄、60日龄、90日龄、120日龄、150日龄和180日龄沙子岭猪睾丸组织中的表达量,结果显示mi R-10b和DAZAP1基因(皮尔森系数为-0.6,P=0.002)、miR-26a和ULK2基因(皮尔森系数为-0.771,P=0.015)均呈显著负相关,同时,Western blot结果证实DAZAP1基因和ULK2基因在各样品中的蛋白表达水平与mRNA表达水平一致。通过分别构建DAZAP1基因和ULK2基因正常型3′-UTR和突变型3′-UTR载体并与miR-10b/26a mimic和mimic NC转染入猪睾丸细胞系,双荧光素酶活性检测结果显示DAZAP1基因、ULK2基因分别为miR-10b、mi R-26a的靶基因。随后,将miR-10b/26a mimic、mimic NC、inhibitor、inhibitor NC转染入ST细胞系,实时荧光定量PCR和Western blot检测结果显示miR-10b在mRNA和蛋白水平均能抑制DAZAP1基因的表达,miR-26a在mRNA和蛋白水平均能抑制ULK2基因的表达。综上所述,本研究从miRNA和mRNA两个水平系统研究了猪睾丸组织发育过程中差异表达基因,并对这些差异表达基因进行了功能注释、通路分析及互作网络调控分析等;并在组织和细胞水平验证了miR-10b和miR-26a的靶基因。为研究猪睾丸发育和精子生成的分子机制提供了宝贵的遗传资源与材料,并且有助于提高对猪转录组遗传结构的认识和理解。