论文部分内容阅读
目的:目前,肺癌的发病率及病死率仍居恶性肿瘤首位。肺癌的治疗中,非小细胞肺癌首选铂类药物为基础的联合化疗方案,但逐渐增多的铂类药物耐药性严重影响了NSCLC的治疗。为此,本研究以人肺腺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP细胞为模式细胞,首先采用高通量测序（RNA-Seq）方法分析其与亲本A549细胞差异表达基因,并利用GO Terms和KEGG进行差异基因的功能富集分析,筛选出NSCLC顺铂耐药差异基因功能分区。其次,基于RNA-Seq筛选结果,探讨miRNA-21靶向肿瘤细胞糖酵解途径调控NSCLC顺铂耐药的分子机制。最后,利用古方参冬饮的现代中药制剂—参麦注射液为益气养阴法代表方药干预体外培养的A549/DDP细胞,探讨参麦注射液逆转NSCLC顺铂耐药的分子药理机制,为益气养阴法治疗NSCLC提供实验室数据。材料与方法:论文一:（1）细胞培养A549细胞及A549/DDP细胞于含10%FBS的DMEM培养液中,在37℃、95%湿度、5%CO2条件下进行培养。A549/DDP细胞于低浓度顺铂（7μM）环境下持续培养以保持其顺铂耐药性,并于实验前2周更换为无顺铂的培养液。（2）CCK-8法检测A549/DDP细胞耐药指数取对数生长期的A549细胞和A549/DDP细胞接种于96孔板,贴壁过夜。去掉培养液,加入含不同浓度顺铂的DMEM培养液干预细胞24 h,每孔加入10μL的CCK-8溶液,在37℃孵育4 h后,于OD460nm处检测吸光度值,根据改良寇式计算公式计算出IC值。（3）细胞葡萄糖及乳酸含量测定对数生长期的A549细胞及A549/DDP细胞,经胰酶消化后收集细胞,每1×106个细胞加入0.1 m L的裂解液裂解细胞,将工作液与样品稀释液混合,于37oC反应20 min,测定OD530nm值。（4）RNA-Seq测序分析A549细胞及A549/DDP细胞经trizol抽提得到总RNA、构建测序文库、Real Time PCR方法对文库进行定量、RNA-Seq表达量分析、基因表达水平的PCA和相关性分析、基因/转录本差异表达分析、功能基因和涉及的信号通路富集分析,分析A549/DDP细胞差异基因的表达谱。（5）Real Time PCR验证RNA-Seq结果的准确性收集A549细胞和A549/DDP细胞,提取总RNA、反转录反应及Real Time PCR反应验证差异基因的表达情况。论文二:（1）miRNA-21 sponge转染细胞实验A549/DDP细胞接种到24孔板,细胞密度在60-80%,将Golden Tran DR试剂和miRNA-21 NC/miRNA-21 sponge混合后立即加入至细胞表面,培养56 h后,进行mRNA或蛋白检测。（2）miRNA-21 sponge联合顺铂干预A549/DDP细胞检测细胞糖酵解水平收集并裂解A549/DDP细胞,将葡萄糖和乳酸检测试剂工作液与样品稀释液混合,在37oC温箱内,反应20 min,测定OD530nm值。（3）miRNA-21 sponge联合顺铂干预A549/DDP细胞检测信号通路蛋白表达水平分别收集顺铂、miRNA-21 sponge及联合干预的A549/DDP细胞,裂解细胞提取各组细胞的总蛋白,BCA方法对各组细胞的总蛋白含量进行测定,利用免疫印迹方法和Image J软件分析蛋白表达水平的差异。（4）LC3B荧光斑点的检测4%多聚甲醛固定A549/DDP细胞,加入1%Tritonx-100溶液浸润细胞,再加入LC3B抗体4℃下孵育过夜,最后加入FITC标记的兔源Ig G二抗孵育1 h,在荧光显微镜下观察并拍照。（5）透射电镜观察细胞死亡情况胰酶消化A549/DDP细胞后离心收集细胞,加入2.5%戊二醛过夜,磷酸盐缓冲液洗涤后加入饿酸固定液固定2 h,磷酸盐缓冲液洗涤后,进行梯度脱水,丙酮与包埋剂进行包埋和渗透,进行切片,且对切片进行醋酸双氧铀染色和柠檬酸铅染色,最后透射电镜观察并拍照。论文三:（1）CCK-8法测定参麦注射液干预A549/DDP细胞活力A549/DDP细胞接种于96孔板,贴壁过夜后去掉培养液,加入含不同浓度参麦注射液的DMEM培养液干预细胞24 h。每孔加入10μL的CCK-8溶液,在37℃孵育4 h后,于OD460nm处检测吸光度值,根据改良寇式计算公式计算出IC值。（2）参麦注射液联合顺铂干预A549/DDP细胞检测糖酵解水平收集并裂解A549/DDP细胞,将葡萄糖和乳酸检测试剂工作液与样品稀释液混合,在37oC温箱内,反应20 min,测定OD530nm值。（3）参麦注射液联合顺铂干预A549/DDP细胞检测信号通路蛋白表达水平分别收集顺铂、参麦注射液及联合干预的A549/DDP细胞,裂解细胞提取各组细胞的总蛋白,BCA方法测定各组细胞的总蛋白含量,利用免疫印迹方法和Image J软件分析蛋白表达水平差异。（4）Ed U方法检测参麦注射液联合顺铂干预A549/DDP细胞增殖能力4%多聚甲醛固定A549/DDP细胞,加入甘氨酸溶液中和甲醛,加入0.5%Triton X-100通透液,然后加入Ed U染色,最后加入Hoechst 33342复染,置于DAPI和CY3荧光模块下进行观察并获取图片。结果:论文一1.A549/DDP细胞与A549细胞在形态、顺铂敏感性及糖酵解水平上存在差异在高倍镜下观察,顺铂耐药A549/DDP细胞和其亲本A549细胞在形态上存在显著的差异,相比于A549细胞,A549/DDP细胞体积和细胞间隙明显增大。利用不同浓度顺铂分别干预A549细胞与A549/DDP细胞,CCK-8法获得两株细胞的IC50值分别为:37.8μM和63.3μM。A549/DDP细胞耐药指数（Resistant index,RI）为1.67,即与A549细胞相比,A549/DDP细胞具有更高的顺铂耐药性。此外,获得A549/DDP细胞的IC5、IC10及IC20值分别为6.6、12.3及23.3μM。通过对葡萄糖消耗和乳酸生成的测定,结果显示A549/DDP细胞糖酵解水平显著高于A549细胞糖酵解水平。2.RNA-Seq数据分析及差异表达基因功能富集分析利用高通量测序（RNA-Seq）比较A549/DDP细胞与其亲本A549细胞的差异基因表达。与A549细胞相比,A549/DDP细胞上调的差异表达基因约有2200个,下调的差异表达基因约有4300个。通过Real Time PCR的方法,将A549/DDP细胞中差异表达基因上调前8位和下调前8位的基因做进一步验证,结果显示与RNA-Seq测序结果基本一致。此外,研究这些差异基因所涉及的调控通路,我们通过GO Terms和KEGG进行富集分析结果显示A549/DDP细胞发生显著变化的有:细胞周期、DNA复制、代谢途径和酶活性等。3.调控糖代谢通路的ceRNA网络构建和miRNA预测将差异显著的糖代谢基因（PKM2,LDHA,ALDOA,ENO1,ENO2,HK1,PGAM1）利用Target Scan和miRNA软件对microRNA靶标进行预测,构建ceRNA网络图。此外,还通过Pubmed数据库、Embase数据库及CBM数据库挖掘miRNA-21可能与NSCLC顺铂耐药相关。论文二1.miRNA-21在A549/DDP细胞中高表达Real Time PCR结果显示,与其亲本A549细胞相比,miRNA-21在顺铂耐药A549/DDP细胞中高表达,miRNA-21在A549/DDP细胞中的表达上调了5倍。2.miRNA-21 sponge联合顺铂通过干预PI3K/Akt/m TOR/HIF-1α信号通路抑制A549/DDP细胞的糖酵解在前面的结果中已经证明,miRNA-21在A549/DDP细胞中高表达,为了进一步研究miRNA-21在A549/DDP细胞中的功能,我们构建了miRNA-21 sponge（质粒型microRNA抑制子载体）抑制miRNA-21的表达。通过葡萄糖和乳酸检测试剂盒测定,与miRNA-21 NC和顺铂单独干预A549/DDP细胞相比,miRNA-21 sponge联合顺铂共同干预A549/DDP细胞可降低细胞葡萄糖消耗、丙酮酸生成及乳酸生成。此外,通过Western blot方法检测miRNA-21 sponge联合顺铂可显著降低A549/DDP细胞糖酵解相关酶PKM2和LDHA蛋白的表达。进一步研究发现,miRNA-21 sponge联合顺铂通过干预PI3K/Akt/m-TOR/HIF-1α信号通路,降低A549/DDP细胞的糖酵解水平。3.miRNA-21 sponge联合顺铂诱导A549/DDP细胞凋亡及自噬性死亡首先,通过观察荧光标记的LC3B抗体发现,顺铂、miRNA-21sponge及miRNA-21sponge联合顺铂干预后的A549/DDP细胞,细胞内发生不同程度的自噬作用,miRNA-21sponge联合顺铂共同干预A549/DDP细胞时产生的自噬小体数量最多。其次,通过DAPI对细胞核进行染色观察发现,顺铂、miRNA-21sponge及miRNA-21sponge联合顺铂共同干预A549/DDP细胞核周围均出现了核碎片,且miRNA-21sponge联合顺铂共同干预A549/DDP细胞时产生的核碎片数量最多。最后通过透射电镜观察,顺铂和miRNA-21sponge单独干预A549/DDP细胞可明显观察到自噬小体和自噬溶酶体数量的增多,当miRNA-21sponge联合顺铂共同干预A549/DDP细胞时,A549/DDP细胞周围出现了坏死。此外,通过Western blot方法检测,miRNA-21sponge联合顺铂共同干预A549/DDP细胞凋亡相关蛋白cleave caspase-3和Bax表达显著增加,而Bcl-2表达降低;细胞内自噬相关蛋白LC3B和ATG7表达也显著增加。论文三1.A549/DDP细胞糖酵解相关酶表达升高基于高通量测序结果,已经证实A549/DDP细胞相比其亲本A549细胞,糖酵解途径中的相关酶PKM2和LDHA表达升高。为了更进一步阐明糖酵解水平升高的原因,我们对参与糖酵解所有的相关酶表达水平进行了检测,通过Real Time PCR和Western blot实验结果显示,与其亲本A549细胞相比,A549/DDP细胞中HK2、PKM1/2、PKM2、GLUT1和LDHA的mRNA和蛋白表达水平均显著升高。2.参麦注射液抑制A549/DDP细胞增殖参麦注射液对A549/DDP细胞具有毒性作用,且呈现浓度正相关性。通过CCK-8方法检测得出参麦注射液对A549/DDP细胞的IC50为40.0 mg/m L,IC5、IC10和IC20分别为10.0、15.0和20.0 mg/m L。3.参麦注射液增强顺铂对A549/DDP细胞毒性作用参麦注射液对顺铂具有增强毒性作用,当顺铂联合参麦注射液浓度分别为10.0、15.0和20.0 mg/m L时,顺铂对A549/DDP细胞的IC50值从63.6μM分别下降到21.0μM、20.3μM和13.7μM,逆转指数分别从3.1上升到3.5和4.6。当顺铂联合参麦注射液浓度为20.0 mg/m L时,与顺铂单独干预相比可显著降低A549/DDP细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成。此外,通过Western blot方法检测参麦注射液联合顺铂可抑制A549/DDP细胞中HK2、PKM1/2、GLUT1及PDH蛋白的表达。4.参麦注射液通过干预PI3K/Akt/m TOR/c-Myc信号通路增强顺铂毒性作用与顺铂单独干预相比,参麦注射液联合顺铂共同干预可显著降低A549/DDP细胞p-Akt（Ser 473）、p-Akt（Thr 308）、p-m TOR（Ser 2448）和c-Myc的蛋白表达。为了证实参麦注射液增强顺铂毒性作用是通过PI3K/Akt/m TOR/c-Myc途径实现的,分别选取了PI3K/Akt/m TOR/c-Myc通路不同位点的抑制剂加以干预,结果显示蛋白表达变化趋势与LY294002、雷帕霉素及10058-F4干预预期结果相一致,证明参麦注射液增强顺铂毒性是通过PI3K/Akt/m TOR/c-Myc途径实现的。5.参麦注射液联合顺铂抑制A549/DDP细胞增殖,诱导细胞凋亡与顺铂单独干预相比,参麦注射液联合顺铂共同干预A549/DDP细胞,细胞的增殖率下降了约60%。此外,通过Western blot方法检测细胞内凋亡相关蛋白cleave caspase-3和Bax表达水平显著的降低,Bcl2表达水平显著的升高。结论:1.转录组学数据表明,顺铂耐药A549/DDP细胞糖代谢水平升高。2.miRNA-21通过PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制A549/DDP细胞糖酵解增加NSCLC顺铂敏感性。3.参麦注射液调节PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制A549/DDP细胞糖酵解增加NSCLC顺铂敏感性。