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目的：到2010年，全球糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）患者总数将增加到2.2亿。在25-74岁的人口中，中国DM患者每年增加754，000人，21世纪将仅位于印度之后成为DM第二大国。在糖尿病中枢神经系统并发症中，对糖尿病引起的昏迷、糖尿病脑血管病变研究较多，而对糖尿病引起的认知功能障碍即糖尿病脑病认识不足。糖尿病脑病是慢性进展性疾病，是一种中枢神经系统退行性变。糖尿病可通过非酶蛋白糖基化、氧化应激、多元醇旁路和蛋白激酶C激活多种途径对中枢神经系统产生影响，具体机制不明，更缺乏特异性的治疗。近年来的研究表明，晚期糖基化终末产物（advanced glycation end-products，AGEs）、晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end-products，RAGE）和转录核因子-kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-κB）在糖尿病并发症的发生、发展中具有重要意义，但对其在糖尿病中枢神经病变，特别是在糖尿病脑病发病机制中的作用研究较少。葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidin extracts，GSPE）具有抗氧化、抑制糖尿病非酶性糖基化、减少氧化应激反应和细胞修复等作用，有望成为治疗糖尿病并发症的新药。本研究利用链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）所致糖尿病大鼠模型，试图从高血糖诱发的AGEs／RAGE／NF-κB信号转导途径入手，探讨糖尿病脑病-主要是糖尿病大鼠海马退行性变的发病机制，以及GSPE改善糖尿病海马神经元细胞、胶质星行细胞退行性变的可能机制，为预防、治疗糖尿病脑病寻找新的方向。材料与方法：健康雄性Wistar大鼠60只，体重180-220g。实验动物饲以标准颗粒饲料，分笼喂养，饮食自由，自然昼夜光线照明，实验室内通风良好，温度保持在18-25℃，相对湿度为40-70％。实验前动物测定随机血糖、称重。按空腹体重编号，随机选出10只作为正常对照组（C1组），10只为正常对照加GSPE治疗组（C2组，予以GSPE 250mg／kg/日灌胃）。余40只大鼠适应性喂养7天后，禁食12h。以0.1mol／L、PH4.2的柠檬酸盐缓冲液溶解STZ，配成新鲜的2％的STZ溶液，经滤菌器除菌。实验组按55mg／Kg一次性尾静脉注射，正常对照组注射同等剂量的柠檬酸盐缓冲液。注射后每天后取鼠尾微量血测定血糖（采用强生公司One-Touch Ultra血糖仪），尿糖试纸检测定性尿糖。尿糖在+++以上，血糖＞16.7mmol／L者定为糖尿病大鼠。成模后每周测定一次定性尿糖，每周测定一次血糖和体重。成模糖尿病大鼠30只，平衡一周后，随机分为2组：15只作为糖尿病组（DM1组），15只为正常对照并GSPE治疗组（DM2组，予以GSPE 250mg／kg／日灌胃）。每周检测空腹血糖、体重，标准饲养24周后取血测定血清AGEs和糖化血红蛋白，大鼠断头取脑并分离海马，利用HE染色、神经生长因子和胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acid protein，GFAP）免疫组织化学染色观察海马形态，逆转录一聚合酶链式反应检测AGEs／RAGE和NF-κB mRNA表达，免疫组织化学和Western Blot方法研究海马神经元AGEs／RAGE和NF-κB蛋白表达。统计学分析：所有数据均以均数±标准差（x±SD）表示，用SPSS13.0软件进行分析。样本间均数的比较采用t检验或方差分析。P＜0.05表示有统计学意义。结果：1．一般观察糖尿病大鼠污秽无泽，生长缓慢，血糖波动在较高水平（＞20mmol／L），其中多只因严重感染而死亡，未纳入最后统计。GSPE治疗组糖尿病大鼠上述表现减轻，血糖降低，但仍高于正常对照组大鼠。正常对照组大鼠无糖尿病症状，生长及营养状况良好。2．血糖、糖化血红蛋白及体重的比较实验前4组大鼠的血糖、体重均无统计学差异（p＞0.05）。实验终止时，糖尿病大鼠体重明显低于正常对照组大鼠同期体重（t=16.791，P＜0.001），而血糖和HbA1C则显著高于对照组（P＜0.05）；DM2组大鼠与DM1相比，体重有增长但无显著差异（p＞0.05），血糖控制好转但无显著差异（p＞0.05）。糖尿病组FPG、HbA1C和体重与正常组比较均有显著性差异，说明糖尿病模型动物是可靠的。C1和C2组肝、肾功均正常，无差异（p＞0.05），说明GSPE干预剂量适当，未产生毒副作用。3．海马神经元形态学观察糖尿病大鼠海马神经元发生退形性改变：神经元细胞层不完整，其中许多细胞胞体缩小，胞浆呈淡红色，胞核固缩深染，排列亦疏散不规则。正常对照组海马神经元较大，形态完整，排列规则且密集，层次清晰。糖尿病组海马CA区神经元较对照组减少（t=3.672，P=0.002），GSPE干预后DM2组DM1组相比神经元数目增加（t=-2.702，p=0.015）。这种改变提示：糖尿病大鼠脑内存在海马及皮层神经元退行性改变，造成神经元数目减少，GSPE可以改善、修复被损伤的神经元，对海马有保护作用。4．海马星形细胞增生性改变实验结束时，免疫组织化学结果显示：与对照组相比，糖尿病组海马星形细胞GFAP染色灰度值减少（t=3.065，p=0.007），GFAP阳性细胞个数增多（t=-3.524，p=0.005），表明GFAP蛋白表达增加。GSPE治疗后DM2和DM1组相比海马星形细胞GFAP染色灰度值增加（t=-2.360，p=0.030），GFAP阳性细胞个数减少（t=2.981，p=0.013），表明GFAP蛋白表达减少。糖尿病大鼠海马CA区GFAP表达增加，提示糖尿病组存在脑损伤的激活和胶质星形细胞增生，GSPE对胶质星形细胞增生有改善作用。5．GSPE对STZ致糖尿病大鼠RAGE／AGEs和NF-κB表达的影响5．1海马RAGE mRNA表达与对照组相比，糖尿病组大鼠海马内RAGE mRNA表达增加（t=-3.795，P=0.002），经GSPE治疗后，DM2组和DM1组相比海马RAGEmRNA表达降低，差别均有统计学意义（t=2.588，P=0.019）。5．2海马NF-κB mRNA表达与对照组相比，糖尿病组大鼠海马内NF-κBmRNA表达增加（t=-3.972，P=0.002），经GSPE治疗后，DM2组和DM1组相比大鼠海马NF-κB mRNA表达降低，差别均有统计学意义（t=3.480，P=0.003）。5．3海马RAGE蛋白表达免疫组化染色显示，实验结束时，糖尿病组大鼠海马CA区神经元细胞上RAGE阳性染色颗粒丰富，而DM2组较DM1组RAGE阳性染色颗粒明显减少。糖尿病组较对照组海马RAGE灰度值减少（t=2.482，p=0.027），阳性细胞数增加（t=-5.218，p＜0.001），表明蛋白表达增加；GSPE治疗后DM2和DM1组相比海马RAGE灰度值增加（t=-2.437，p=0.026），阳性细胞数减少（t=3.609，p=0.003），表明RAGE蛋白表达减少。5．4海马NF-κB蛋白表达免疫组化染色显示，糖尿病组大鼠海马CA区神经元细胞NF-κB阳性染色颗粒丰富，而DM2组较DM1组RAGE阳性染色颗粒明显减少。实验结束时，糖尿病组较对照组海马NF-κB灰度值减少（t=2.747，p=0.019），阳性细胞数增加（t=-3.720，p=0.002），表明蛋白表达增加；GSPE治疗后DM2和DM1组相比海马NF-κB灰度值增加（t=-2.859，p=0.017），阳性细胞数减少（t=4.302，p=0.001），表明蛋白表达减少。5．5 Pearson相关分析表明，糖尿病大鼠海马CA区NF-κB、RAGE表达和血清AGEs水平呈正相关。结论：1、糖尿病组大鼠海马与非糖尿病组相比神经元细胞数目减少，发生明显退行性改变，经GSPE干预后神经元形态改善，数目增加。2、糖尿病组大鼠血清AGEs水平增高，海马CA区RAGE mRNA表达与正常对照组相比明显增加，经GSPE治疗后其表达降低。3、糖尿病组大鼠海马CA区NF-κB mRNA表达与正常对照组相比明显增加，经GSPE治疗后其表达降低。4、糖尿病组大鼠海马CA区RAGE蛋白表达与正常对照组相比明显增加，经GSPE治疗后其表达降低。5、糖尿病组大鼠海马CA区NF-κB蛋白表达与正常对照组相比明显增加，经GSPE治疗后其表达降低。6、糖尿病大鼠海马CA区RAGE、NF-κB表达与血清AGEs水平呈正相关。AGEs／RAGE和NF-κB在糖尿病脑病的发生中起了重要的作用。GSPE通过阻断AGEs／RAGE的结合效应，使海马CA区NF-κB表达减少，使神经元数目增多，星行细胞增生减少，退行性变程度降低，对糖尿病大鼠脑病有治疗、改善作用。以上研究结果提示慢性高血糖能引起大鼠海马AGEs／RAGE和NF-κB表达增加，糖尿病大鼠海马CA区RAGEmRNA、NF-κB蛋白表达含量与血清AGEs呈正相关，长期高血糖通过激活AGEs／RAGE和NF-κB通路使神经元细胞结构和功能产生退行性改变。GSPE治疗后，海马CA区RAGE和NF-κB表达均降低，神经元退行性变得到改善，GSPE通过阻断AGEs／RAGE／NF-κB信号转导通路对糖尿病大鼠脑病起保护作用，可望成为治疗糖尿病脑病的新药。