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犬弓首蛔虫（Toxocaracanis）是一种世界性分布的犬科动物肠道寄生线虫，可感染人和多种哺乳动物，引起严重的人兽共患寄生虫病。在终末宿主体内，T.canis感染性幼虫经内脏移行最终在肠道内发育为成虫。在非特异性宿主体内，感染性幼虫则不能发育为成虫，只能移行到宿主肌肉、内脏和神经系统等部位，成为滞育的第3期幼虫。非特异性宿主因误食未煮熟的肉/内脏中的感染性幼虫或受污染的土壤、蔬菜中的感染性虫卵而感染该寄生虫，引起眼睛幼虫移行症、内脏幼虫移行症、神经幼虫移行症和隐性弓首蛔虫病等。 水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是细胞膜上一类具有跨膜转运水分子功能的蛋白，能促进水和其他小分子物质如甘油、气体、尿素、氨和离子通过细胞膜。此外，它还参与细胞迁移、脑水肿、神经兴奋和脂肪代谢等生物学过程。根据渗透性能，水通道蛋白可分为三大类：传统的水通道蛋白、水-甘油通道蛋白、超级水通道蛋白。传统的水通道蛋白为选择性水通道，只对水有渗透性。水-甘油通道蛋白为非选择性水通道，除了转运水以外，还对甘油或尿素有渗透性。超级水通道蛋白的功能目前还尚不清楚。AQPs是水跨膜转运的主要分子基础，广泛分布于各种生物体，如哺乳动物、昆虫、植物、酵母甚至细菌。AQPs在寄生虫中也发挥着重要的作用，除了运输水以外，还参与虫体渗透压的调节、营养物质的吸收、代谢废物的排出等生理过程。AQP1是第一个被发现并命名的水通道蛋白，可促进内皮细胞迁移，血管形成，介导跨膜水转运，影响肿瘤细胞扩散，调节营养代谢和血管舒缩功能。目前已有秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans）、曼氏血吸虫(Schistosomamansoni)、大片吸虫（Fasciolagigantica）、麝猫后睾吸虫（Opisthorchisviverrini）、硕大利什曼原虫（Leishmaniamajor）、布氏锥虫（Trypanosomabrucei）、刚地弓形虫（Toxoplasmagondii）等的AQP1相关研究，寄生线虫AQP1的研究还未见报道。 本研究克隆了犬弓首蛔虫水通道蛋白1基因（Tc-aqp-1）完整的编码区序列，对TcAQP1的组织分布情况进行了研究，并用RNA干扰技术对Tc-aqp-1基因功能进行了探讨，试验结果总结如下： 1.Tc-aqp-1基因的克隆及序列分析 采用PCR技术扩增了Tc-aqp-1的完整CDS序列，序列长度为933bp，共编码310个氨基酸残基，预测分子质量大小为34.35kDa。多重序列分析显示，Tc-aqp-1编码的氨基酸序列与O.viverrini，S.mansoni，L.major，T.brucei，C.elegans以及马来丝虫（Brugiamalayi）的AQP1氨基酸序列存在两个完全保守的天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸(Asn-Pro-Ala，NPA)基序，其他序列差异较大。系统发育分析表明，Tc-aqp-1编码的氨基酸序列与C.elegans和B.malayi的进化关系最近。结构和功能预测结果显示，TcAQP1的结合位点为N95、N226、L47、L183、I79、I98，活性位点为I256、G207。分子功能为水的通道活性（GO:0015250），生物学过程为水的运输（GO:0006833），细胞组分为质膜必要组分（GO:0005887）。 2.TcAQP1的原核表达及多克隆抗体的制备 本研究对Tc-aqp-1编码区C-末端亲水区序列进行了克隆，构建了Tc-aqp-1c/pET32a重组表达质粒，并利用EscherichiacoliBL21（DE3）原核表达系统对重组蛋白TcAQP1c进行了外源表达。SDS-PAGE电泳结果表明，重组TcAQP1c在上清中大量表达，大小约为24kDa。优化后的表达条件为1.0mMIPTG诱导，37℃培养6h，可获得大量目的蛋白。采用镍离子亲和层析（Ni-NTA）方法对目的蛋白进行了纯化，用50mM咪唑洗脱时获得高纯度目的蛋白。制备了兔抗TcAQP1c多克隆抗体，经检测，该抗体浓度为0.83mg/mL和0.86mg/mL，滴度>1∶64000。免疫印迹（Westernblot）结果条带单一，表明兔抗TcAQP1c多克隆抗体的特异性好。 3.Tc-aqp-1的组织差异表达和TcAQP1的组织分布 采用实时荧光定量PCR技术对Tc-aqp-1基因在T.canis雌虫和雄虫各组织中的转录情况进行了研究。结果显示Tc-aqp-1在T.canis雌虫和雄虫的肠道转录水平较高，而在雌虫和雄虫的生殖组织和体壁转录水平较低。利用荧光免疫组织化学技术对TcAQP1在T.canis雌虫和雄虫各组织的分布进行了研究。结果显示TcAQP1分布于生殖组织和肠道，尤其在雌虫卵巢和雄虫贮精囊中分布明显。表明Tc-aqp-1除了参与水和溶质的运输，还可能参与T.canis的生殖过程，但其具体的作用机制，还有待后续试验进一步研究。 4.Tc-aqp-1的RNA干扰研究 采用siRNA介导的干扰技术对Tc-aqp-1基因的转录-表达过程进行了干扰，并利用qRT-PCR技术对Tc-aqp-1基因敲低进行了分析。结果显示，在siRNA-168、siRNA-245和siRNA-728三个处理组中，siRNA-245处理组的Tc-aqp-1转录水平明显降低，差异极显著。随后采用0.2mg/mL的阿苯达唑作用于siRNA-245处理组的T.canis。结果显示，siRNA-245处理组的T.canis死亡率（40%）明显低于对照组（71%），说明siRNA-245处理组的阿苯达唑运输受到了抑制，表明TcAQP1与抗寄生虫药物的运输有关，是潜在的药物靶点。