卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,在导致女性死亡的所有肿瘤中排第四位。因发病隐匿,无有效的早期发现指标,发病时多为晚期,卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤[1-3]。据2018年统计,全球范围内,新增卵巢癌患者295414例,其中有184799例死亡[4],而我国过去十年卵巢癌发病率上升了 30%。值得注意的是,约75%的患者诊断时已处FIGO的Ⅲ期或Ⅳ期[5]。目前标准的治疗方案为卵巢肿瘤细胞减灭术+以铂类为基础的联合化疗,然而大多数患者会在12-24个月内复发,多死于对化疗药物耐药[6,7]。尽管随着PARP抑制剂的应用,在治疗铂类敏感复发的卵巢癌患者方面,带来了里程碑式的进步,使卵巢癌的治疗有了新的突破[8]。但对于耐药性卵巢癌的治疗仍是目前治疗的难点和研究的热点。因此,探究卵巢癌顺铂耐药的分子机制和克服铂类耐药的难题,对提高卵巢癌患者的生存率有着重要的意义。程序性细胞死亡蛋白受体1(PD-1)作为CD28超家族的主要细胞表面受体,是降低T细胞活化的主要抑制分子之一[9,10]。其主要配体分子PD-L1在抗原呈递细胞上表达,但也在肿瘤细胞上表达[11]。生理状况下,淋巴细胞表面的PD-1可以与其配体PD-L1相结合抑制淋巴细胞功能,从而防止自身免疫损伤[12]。在病理条件下,PD-1/PD-L1信号通路会被激活,肿瘤表面的PD-L1与T细胞表面的PD-1结合进而抑制T细胞的活性,从而逃避T细胞的杀伤,导致肿瘤免疫逃逸。临床研究发现PD-L1的高表达与恶性肿瘤的不良预后有关[13-15]。PD-L1高表达的患者预后明显差于低表达的患者[16]。铂处理可以在非小细胞肺癌细胞中上调PD-L1的表达,而敲低PD-L1可以明显增加非小细胞肺癌细胞对顺铂敏感性[17]。此外,已有文献报道PD-L1的过表达与卵巢癌患者的预后差相关[18]。然而,目前尚无文献报道研究PD-L1在卵巢癌顺铂耐药中的作用及具体机制。MicroRNA(miRNA)是一类大小为20-25个的非编码小RNA分子,可通过沉默或降解其靶点mRNA分子调控基因表达,在多种病理过程扮演重要角色,可与多种靶信使mRNAs的3’UTR相互作用,进而在转录后水平调控基因表达[19]。近年来,随着对肿瘤耐药研究的深入,miRNA参与肿瘤耐药的机制受到研究人员的广泛关注[20,21]。miR-34a-5p被报道在多种肿瘤组织异常表达,参与肿瘤进展,如在人上皮性卵巢癌中被下调[22];在成人神经管细胞瘤、膀胱癌、卵巢癌细胞中上调miR-34a-5p可以增加顺铂敏感性[23-25]。PD-L1在非小细胞肺癌和急性髓细胞白血病中被证明是miR-34a-5p的靶基因,过表达miR-34a-5p有效负性调控PD-L1的表达[26,27]。卵巢癌中miR-34a-5p是否通过影响PD-L1的表达参与调控卵巢癌对顺铂敏感性,目前尚无报道,有待进一步证实。本研究以此为切入点,从以下三个方面进行研究。第一部分通过临床组织标本及卵巢癌细胞实验检测PD-L1在化疗耐药卵巢组织和耐药细胞中高表达,得到其参与调控卵巢癌顺铂耐药。第二部分在顺铂耐药卵巢癌细胞中,检测发现miR-34a-5p表达降低,过表达miR-34a-5p能有效抑制PD-L1的表达,增加细胞对顺铂的敏感性,双荧光素酶报告基因实验证实两者存在靶向调控关系。第三部分通过裸鼠成瘤体内实验进一步验证,沉默miR-34a-5p能显著促进肿瘤体内生长,使PD-L1的表达升高,得出miR-34a-5p负性调控PD-L1的表达。第一部分PD-L1在卵巢癌组织表达及其在卵巢癌顺铂耐药细胞中的作用研究目的:检测PD-L1在卵巢良性肿瘤组织、化疗敏感卵巢癌组织及耐药卵巢癌组织中的表达差异,以及在卵巢癌细胞株SKOV3、A2780和顺铂耐药卵巢癌细胞(SKOV3/DDP、A2780/DDP)的表达差异;并探讨PD-L1的表达对细胞增殖、周期和凋亡及化疗敏感性的影响。研究方法:1.收集卵巢良性肿瘤组织、化疗敏感卵巢癌组织及化疗耐药卵巢癌的组织的病理切片及临床资料为研究对象,采用免疫组化检测PD-L1蛋白表达水平,RT-qPCR检测卵巢良性肿瘤组织、化疗敏感卵巢癌组织及化疗耐药卵巢癌的组织中PD-L1 mRNA表达水平,分析PD-L1在化疗敏感卵巢癌患者和化疗耐药卵巢癌患者中表达差异,并探讨其临床意义。2.选取卵巢癌细胞株SKOV3、A2780,通过连续梯度增加顺铂(DDP)浓度培养,构建卵巢癌DDP耐药细胞株(SKOV3/DDP、A2780/DDP)。使用不同浓度DDP处理,MTT实验检测卵巢癌细胞株SKOV3、A2780和DDP耐药细胞株(SKOV3/DDP、A2780/DDP)的增殖活力并计算IC50值。3.分别采用RT-qPCR和Western blot检测卵巢癌细胞株SKOV3、A2780和DDP耐药细胞株(SKOV3/DDP、A2780/DDP)中PD-L1表达水平。4.构建shRNA-PD-L1质粒并转染细胞,检测敲降PD-L1后DDP耐药细胞的生物学性能。使用含不同浓度DDP培养,MTT实验检测PD-L1敲降后细胞的增殖活力;流式细胞术测定细胞周期的变化和凋亡率的改变。5.Western blot检测PD-L1敲降后与细胞周期、凋亡和耐药等相关蛋白的表达变化。研究结果:1.PD-L1在卵巢肿瘤组织的表达水平:免疫组化结果显示,PD-L1在耐药卵巢癌组织中的表达量明显高于化疗敏感组和卵巢良性肿瘤组。RT-qPCR检测结果表明,与卵巢良性肿瘤组织相比,PD-L1 mRNA在化疗敏感卵巢癌组织和化疗耐药卵巢癌组织中均表达上调,其中化疗耐药卵巢癌组织中PD-L1的表达量高于化疗敏感卵巢癌组织。这提示,PD-L1在癌组织高表达可能参与卵巢癌耐药。2.本研究成功建立了顺铂(DDP)耐药卵巢癌细胞株(SKOV3/DDP、A2780/DDP)。MTT检测结果显示,顺铂耐药细胞株的增殖活力高于亲本株,且IC50值较亲本株也增高。3.RT-qPCR和Western blot检测结果均表明在DDP耐药卵巢癌细胞中PD-L1表达上调。4.敲降PD-L1对耐药细胞SKOV3/DDP、A2780/DDP的影响:转染shRNA-PD-L1显著抑制了耐药卵巢癌细胞对DDP的耐药,相同浓度的DDP作用下,降低了 DDP耐药细胞株的增殖活力,也降低了耐药细胞株的IC50值,促进了G1期细胞周期阻滞,提高了耐药细胞株的凋亡率。5.Western blot检测显示,在DDP存在的情况下,敲降PD-L1后降低了耐药细胞中多药耐药蛋白1(MDR1)和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的表达水平,并显著增加了 cleaved-caspase-3和cleaved-PARP蛋白在耐药细胞中的表达。研究结论:PD-L1在卵巢癌耐药患者组织和SKOV3/DDP、A2780/DDP细胞中高表达,参与调控SKOV3/DDP、A2780/DDP对顺铂的耐药。第二部分miR-34a-5p通过靶向PD-L1调控卵巢癌细胞耐药作用研究目的:探讨miR-34a-5p与PD-L1的靶向关系,研究miR-34a-5p通过调控PD-L1表达影响SKOV3/DDP、A2780/DDP对DDP耐药的作用机制。研究方法:1.采用RT-qPCR检测卵巢癌细胞株SKOV3、A2780和顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP、A2780/DDP 中 miR-34a-5p 的表达水平。2.构建 miR-34a-5p mimic 和 miR-34a-5p inhibitor 表达质粒,分别转染到SKOV3/DDP、A2780/DDP 细胞和 SKOV3、A2780 细胞使 miR-34a-5p 过表达或沉默,RT-qPCR检测miR-34a-5p验证转染效率,分别采用RT-qPCR及Western blot检测PD-L1表达水平变化。3.构建PD-L1 mRNA3’-UTR双荧光素酶报告基因质粒及其点突变质粒,分别与miR-34a-5p mimc混合共转染293T细胞检测荧光素酶活性变化验证miR-34a-5p与PD-L1靶向调控关系。4.将miR-34a-5p mimic和PD-L1过表达载体分别转染或共转染SKOV3/DDP细胞形成不同处理的SKOV3/DDP细胞,使用DDP培养后,MTT实验检测各组细胞的增殖活力;PI染色后Flow cytometry测定细胞周期的变化和Annexin V-FITC/PI试剂盒染色后Flow cytometry测定凋亡率的改变。5.将miR-34a-5p mimic和PD-L1过表达载体分别转染或共转染SKOV3/DDP细胞形成不同处理的SKOV3/DDP细胞,使用DDP培养,Western blot检测PD-L1及耐药基因(MDR1)、细胞周期蛋白(Cyclin D1)和凋亡(cleaved-caspase-3和cleaved-PARP)蛋白的表达水平。研究结果:1.与 SKOV3、A2780 细胞相比,miR-34a-5p 在 SKOV3/DDP、A2780/DDP细胞中显著低表达。2.RT-qPCR及Western blot检测结果均显示,当在细胞中转染miR-34a-5p mimic时,PD-L1表达降低;当转染miR-34a-5p inhibitor时,PD-L1表达升高,差异均具有统计学意义。3.双荧光报告基因实验结果显示PD-L1是miR-34a-5p的靶基因,miR-34a-5p靶向负性调控PD-L1的表达。4.MTT检测结果显示,过表达miR-34a-5p mimic降低了 DDP培养的SKOV3/DDP细胞增殖活力,IC50值降低;同时过表达PD-L1逆转miR-34a-5p mimic对SKOV3/DDP细胞增殖的抑制作用,且IC50值也显著升高。5.流式细胞术检测细胞周期,结果显示过表达miR-34a-5p抑制DDP培养的SKOV3/DDP细胞周期,G1期细胞百分率增多,S期和G2期细胞百分率相应的减少;同时过表达PD-L1逆转miR-34a-5p mimic对细胞周期的抑制作用,使G1期细胞百分率降低,S期和G2期细胞百分率增加。6.流式细胞术检测细胞的凋亡,结果显示,过表达miR-34a-5p促进DDP培养的SKOV3/DDP细胞凋亡,同时过表达PD-L1逆转细胞的凋亡,使凋亡率下降。7.Western blot 检测结果表明 MDR1、Cyclin D1 表达降低,cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的表达升高;同时过表达PD-L1逆转了 miR-34a-5p mimic对细胞凋亡的诱导作用及对 MDR1、Cyclin D1、cleaved-caspase-3 和 cleaved-PARP的蛋白水平的调控作用。研究结论:miR-34a-5p通过靶向下调PD-L1逆转了 SKOV3/DDP对顺铂的耐药。第三部分miR-34a-5p靶向PD-L1调控卵巢癌顺铂耐药的体内实验研究研究目的:通过体内实验,探讨miR-34a-5p靶向下调PD-L1增强SKOV3/DDP对DDP敏感性作用机制。研究方法:1.构建miR-34a-5p稳定过表达或表达沉默质粒,转染SKOV3/DDP细胞,RT-qPCR检测miR-34a-5p表达验证转染效率,Western blot检测转染后SKOV3/DDP细胞中PD-L1的蛋白表达水平。2.选取4周龄健康的BALB/c裸鼠,将裸鼠分为5组,每组10只。将转染后的各组SKOV3/DDP细胞悬液注射到裸鼠右侧腋窝皮下组织,建立裸鼠移植瘤模型,测量肿瘤体积,注射细胞量为1×106个,观察并测量肿瘤生长情况。3.当肿瘤达到一定体积时(50 mm3),以2.0 mg/kg顺铂腹腔内注射4周,每3天注射一次,从注射顺铂开始后,第6天开始测量肿瘤大小,绘制肿瘤生长曲线。实验裸鼠处死后,检测裸鼠成瘤体积大小、重量。4.提取每组裸鼠肿瘤组织,采用TUNEL法染色检测细胞凋亡水平,RT-qPCR法检测miR-34a-5p和PD-L1 mRNA的表达,Western blot法检测PD-L1以及与细胞周期、凋亡和耐药等相关蛋白的表达变化。研究结果:1.成功建立miR-34a-5p稳定过表达或表达沉默SKOV3/DDP细胞,Western blot检测转染后各组细胞,过表达miR-34a-5p后SKOV3/DDP细胞中PD-L1的蛋白表达下调,沉默miR-34a-5p后SKOV3/DDP细胞中PD-L1的蛋白表达上调。2.构建裸鼠卵巢癌移植瘤模型,裸鼠成瘤实验结果表明,与其他4组相比,过表达miR-34a-5p后增加移植瘤对DDP的敏感性,肿瘤生长速度降低,体积减少,质量减轻。miR-34a-5p表达沉默促进肿瘤体内生长,增强对DDP的耐药性。3.TUNEL染色结果也表明,过表达miR-34a-5p显著促进了移植瘤组织细胞的凋亡。但沉默miR-34a-5p的效果与此相反。4.过表达miR-34a-5p显著降低了裸鼠肿瘤组织中PD-L1、MDR1、CyclinD1和Bc12的表达,并促进了 Bax、cytochrome C的表达。而miR-34a-5p表达沉默移植瘤组织 PD-L1、MDR1、CyclinD1 和 Bcl2 的表达升高,Bax、cytochrome C的表达降低。研究结论:miR-34a-5p通过靶向沉默PD-L1增强裸鼠卵巢癌皮下移植肿瘤对顺铂的敏感性。本文的创新点1.本研究发现PD-L1在耐药卵巢癌患者组织标本中表达上调,与卵巢癌化疗耐药相关。2.通过卵巢癌耐药细胞和动物模型实验,证实miR-34a-5p可逆转卵巢癌耐药。3.miR-34a-5p靶向负性调控PD-L1,miR-34a-5p/PD-L1分子轴可作为卵巢癌顺铂耐药临床治疗的潜在靶标。