舌鳞状细胞癌(tonguesquamouscellcarcinoma，TSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一。手术、放疗、化疗是目前主要的治疗手段，但总的5年生存率仍只有60％左右，患者的生存质量也不高。因此除现有的治疗方式外，针对造成肿瘤细胞无限增殖的特性，在基因水平进行治疗，将不失为一种非常有前途的肿瘤治疗策略。 一氧化氮(nitricoxide，NO)是生物体内一种小分子气体，一种结构简单的自由基，具有氧化还原性。它在体内发挥着十分重要的生理功能，参与了调节生物体的循环、神经、免疫等一系列生理、病理过程。大量的临床和实验研究表明，NO对肿瘤发生、发展、转移过程发挥着“双刃剑”的作用。NO在发挥抑瘤作用的同时，还具有促进肿瘤生长、发展、侵袭、转移的作用。而NO最终对肿瘤发挥何种作用，与肿瘤组织局部NO浓度、肿瘤类型、以及肿瘤细胞对NO的敏感性等多种因素有关。近期的研究发现，NO与一些与肿瘤细胞凋亡相关因子相互作用，抑制肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤细胞的增殖。更有研究发现，NO与肿瘤的血管形成密切相关。 内源性NO是由一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOS)以L-精氨酸为底物氧化合成的。因此了解NOS在体内的表达是衡量内源性NO的重要指标。生物体内的NOS至少有三种类型，分别为神经型(nNOS)、内皮型(eNOS)、诱导型(iNOS)。其中iNOS作用缓慢而持久，其产生的NO量较多。大量的研究表明许多肿瘤细胞中可见iNOS的表达。 新生血管的形成是肿瘤的生长和侵袭转移的基础。肿瘤组织必须不断的产生新生血管，才能维持其继续生长。肿瘤血管生成受血管生成促进因子和血管生成抑制因子的共同调控。肿瘤的血管形成则表明二者之间的平衡状态被打破。血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是肿瘤新生血管形成最重要的细胞因子，通过一系列作用促进肿瘤的发展。近期的研究发现：NO也是促进肿瘤血管形成的细胞因子，并与VEGF相互作用，共同促进肿瘤血管的生成。许多研究都表明，iNOS和VEGF与肿瘤血管生成密切相关。 RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是一种由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)抑制细胞内源性基因表达的现象。它是动植物生物体内普遍存在的一种现象，是生物体在进化上的一种保守的基因组水平的免疫监控机制。自从1998年Fire在对线虫的研究中偶然发现RNAi这一现象以来，RNA干扰技术做为一种新的分子医学研究的手段，由于其高稳定性、高效率性、高特异性、可遗传性和合成简便等特性，很快就成为众多学者进行反向遗传学研究的一种行之有效的分子生物学工具之一。 在本课题的研究中，我们采用了RNA干扰技术，通过质粒表达载体的形式，将iNOS基因的特异性短发夹状RNA(shorthairpinRNA，shRNA)片断转染入舌鳞癌Tca8113细胞中。流式细胞仪和MTT法分别检测Tca8113细胞的凋亡和增殖活性的变化情况；通过RT-PCR和Western-blotting等实验检测技术，分别从mRNA水平和蛋白表达水平检测iNOS和VEGF基因的表达改变情况。以进一步探讨iNOS基因是否存在对Tca8113细胞中VEGF基因的表达调控。 本研究分两个部分进行：第一部分：RNA干扰iNOS基因对舌鳞癌细胞增殖活性影响的实验研究为研究NO和iNOS对肿瘤细胞凋亡和增殖活性的影响，本实验用脂质体LIPOFECTAMINE2000介导，将由武汉晶赛公司设计并合成的含有iNOS特异性shRNA的pGenesil-1质粒转染入舌鳞癌Tca113细胞株，同时设阴性对照和空白对照。流式细胞仪和MTT法分别检测Tca113细胞的凋亡率和生长曲线的变化情况。免疫组化检测细胞中iNOS的蛋白表达的改变情况。 结果发现在脂质体介导的含iNOS特异性shRNA的质粒转染入舌鳞癌细胞后，实验组Tca8113细胞中iNOS蛋白表达显著低于两对照组；而且实验组细胞的凋亡率也明显高于其它两组(P＜0.05)；另外通过MTT法绘制生长曲线，发现实验组细胞的增殖活性则受到一定的抑制，肿瘤细胞的增殖要弱于另两对照组。 第二部分：iNOS基因沉默抑制Tca8113细胞VEGF表达的实验研究前期实验已证明RNAi能使iNOS基因表达下降，为了能够进一步探讨iNOS基因是否存在对肿瘤细胞VEGF的表达起调控作用，并为后期进行体内和临床实验研究提供理论依据。本实验通过LIPOFECTAMINE2000脂质体介导，将含有iNOS基因的特异性短发夹状RNA(shorthairpinRNA，shRNA)片断的质粒表达载体转染入Tca8113细胞中(具体方法见第一部分)。通过RT-PCR和Western-blotting等实验检测手段，分别从mRNA水平和蛋白表达水平检测Tca8113细胞的iNOS和VEGF表达的改变情况。 结果发现通过沉默iNOS基因，实验组Tca8113细胞中除iNOS基因的表达有显著下降外(P＜0.05)，VEGF基因在mRNA水平和蛋白水平的表达也有一定程度的降低(P＜0.05)。 结论综合上述实验结果，可以得出结论：1.舌鳞癌Tca8113细胞中有iNOS的高表达； 2.RNAi可以降低iNOS基因的表达，达到基因沉默的效果； 3.通过RNAi沉默iNOS基因可提高Tca8113细胞的凋亡，并降低Tca8113细胞的细胞增殖活性； 4.iNOS和VEGF之间存在着密切联系。iNOS基因沉默可以降低Tca8113细胞中VEGF的表达水平。