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目的:双酚A（Bisphenol A,BPA）是一种常见的环境内分泌干扰物,结构上类似于17β-雌二醇,是生产聚碳酸酯塑料和环氧树脂的前体物质。BPA被广泛应用于食品包装材料、婴儿奶瓶、热敏纸和牙科密封剂等的制造,是世界上生产量最高的化学物之一。近年研究发现BPA对骨骼具有明显损伤作用。BPA可以影响激素系统,与雌激素受体（estrogen receptor,ERs）和雄激素受体（androgen receptor,ARs）结合,打破内源性激素的稳态,进而影响骨骼生长发育。但是,BPA对大鼠四肢骨和中轴骨骨骼发育的影响及相关机制尚不清楚。本研究通过孕哺期染毒动物模型及体外胫骨器官培养模型,观察BPA对四肢骨和中轴骨生长发育的影响及生长板厚度和骨小梁形态的影响。采用ELISA检测子代血清E2和IGF1的含量,探究BPA是否通过影响全身激素水平抑制骨骼生长。采用免疫组化检测生长板雌激素受体及增殖和凋亡标志蛋白的变化,探究孕哺期BPA暴露是否通过激活雌激素受体抑制生长板软骨细胞增殖,促进其凋亡,导致生长板衰老闭合。采用免疫组化检测衰老标志蛋白Bag-1及P53/P21信号通路蛋白的表达,探讨孕哺期BPA暴露是否通过P53/P21信号通路加速生长板衰老闭合。实验方法:体内实验:取8周龄Wistar大鼠,雌雄各18只,适应性喂养1周后将大鼠按照雌雄比1:1的比例每晚7时合笼,次日清晨8时检查是否有阴栓生成,发现阴栓记为妊娠第0天。孕鼠随机分为3组,对照组（饮用含0.01%无水乙醇的蒸馏水）,0.01mg/L BPA组,0.1mg/L BPA组。孕鼠从妊娠0天（GD0）到子代大鼠出生后第21天（PND21）断乳期经饮水染毒。断乳后各组子代大鼠均饮用蒸馏水。取0至4周龄子代大鼠,测量体重,麻醉后测体长、尾长,剥离并测量左侧胫骨和股骨长度。取4周龄仔鼠左侧胫骨和尾椎,多聚甲醛固定2天、15%EDTA脱钙、梯度酒精脱水,石蜡包埋后制备5μm切片。HE染色观察胫骨和尾椎生长板的形态并采用Osteo Measure骨测量软件分析骨小梁形态学指标;免疫组化染色检测生长板雌激素受体（ERα、ERβ）、增殖标志物（Ki67）、凋亡标志物（Bcl2、Bax、Caspase3）、衰老标志物（Bag-1）及P53/P21信号通路蛋白的表达。腹主动脉取血静置40min后4000r/min离心15min获得上清,分装储存于-80℃超低温冰箱备用。通过ELISA检测血清中E2和IGF1的含量。体外实验:在SD孕鼠孕20天取胎鼠后肢胫骨,一侧为对照组,另一侧为BPA组。常规培养于αMEM培养基（含0.2%牛血清白蛋白、0.05mg/ml抗坏血酸、1mmol/Lβ甘油磷酸钠和1×10~5U/L青、链霉素）、5%CO2、37℃培养7天或14天,隔天换液。体式显微镜采集图像并测量胫骨全长及矿化长度,计算相对纵向生长率。组织固定脱钙包埋后制备5μm石蜡切片,进行甲苯胺蓝染色测定骺软骨各区厚度;HE染色后采用Osteo Measure骨测量软件分析骨小梁形态学指标;免疫组化检测软骨细胞增殖标志物（Col2a1）。SPSS19.0统计软件进行统计分析,多组分析采用方差分析方法,配对分析选择配对t检验。结果:体内实验:1、孕哺期BPA暴露对子代大鼠体重和体长的影响:与对照组相比,孕哺期BPA暴露组子代大鼠体长、尾长、胫骨长和股骨长明显下降（P＜0.05）,0.01mg/L BPA组较0.1mg/L BPA明显,雌鼠较雄鼠明显。2、孕哺期BPA暴露对子代大鼠血清IGF1和E2水平的影响:与对照组相比,BPA暴露组子代雌鼠血清IGF1显著降低（P＜0.01）,血清E2水平各组未见统计学差异。3、孕哺期BPA暴露对子代大鼠骨组织形态的影响:BPA暴露组较对照组4周龄子代雌鼠胫骨生长板总厚度、静息区和肥大区厚度均明显降低（P＜0.05）,生长板软骨细胞细胞体积变小且排列紊乱,软骨细胞密度下降;骨小梁分布变稀疏厚度变薄定量后显示骨体积分数BV/TV、骨面积分数BS/TV、骨小梁厚度Tb.Th和骨小梁数量Tb.N下降,Tb.Sp升高（P＜0.05）。BPA暴露组4周龄子代雌鼠尾椎生长板总厚度和增殖区厚度均明显降低（P＜0.05）。4、孕哺期BPA暴露对子代大鼠生长板软骨细胞增殖凋亡的影响:与对照组相比,BPA暴露组子代雌鼠胫骨生长板增殖标志物Ki67和凋亡标志物Bcl2表达降低,Bax和Caspase3表达升高。5、孕哺期BPA暴露对子代大鼠胫骨和尾椎生长板软骨细胞雌激素受体表达的影响:与对照组相比,BPA暴露组子代大鼠胫骨和尾椎生长板ERα和ERβ表达均明显升高（P＜0.05）。6、孕哺期BPA暴露对子代大鼠生长板衰老标志蛋白Bag-1和P53/P21信号通路的影响:BPA暴露组较对照组子代雌鼠胫骨和尾椎生长板软骨细胞衰老标志蛋白Bag-1表达降低（P＜0.05）,P53/P21通路蛋白表达升高（P＜0.05）。体外实验:1、染毒7天后BPA组胫骨全长和矿化区长相对纵向生长率均较对照组显著降低（P＜0.05）。骺软骨形态计量学显示BPA染毒组骨骺软骨总长度、静息区长度、增殖区长度和肥大区长度均显著降低（P＜0.05）。观察骨小梁发现骨小梁分布变稀疏,定量后显示BV/TV、BS/TV和Tb.N下降（P＜0.05）,Tb.Sp升高（P＜0.05）。2、追赶实验显示Catch-up组与对照组相比7～14天骨纵向生长率降低,然而,与BPA染毒组相比7～14天骨纵向生长率增加。3、免疫组化显示BPA染毒组Col2a1表达较对照组明显降低（P＜0.05）。结论:1、BPA通过降低血清胰岛素样生长因子1和直接作用抑制骨骼生长。2、孕哺期BPA暴露可上调子代大鼠生长板雌激素受体,加速生长板衰老。3、孕哺期BPA暴露可能通过上调P53/P21信号通路加速生长板衰老。