鸡球虫病是一类由专性细胞内寄生的艾美耳球虫引起的肠道原虫疾病。据估计每年全世界用于预防和治疗球虫病成本会超过30亿美元,中国每年约有30多亿人民币。目前球虫病的防控主要依靠药物与疫苗,随着耐药虫株的出现和针对抗球虫药物的立法限制,人们更加重视免疫预防。市场上的疫苗主要为多种鸡艾美耳球虫活卵囊的混合,具有很好的免疫保护效果,但是由于活疫苗存在安全问题以及较高的生产成本,研究者们将更多的精力用于以亚单位为基础的新型分子疫苗的研制。新型分子疫苗研制依靠具有较好抗原性以及免疫原性的抗原,由于球虫复杂的抗原结构以及生活史,抗原鉴定的难度以及抗原免疫原性筛选的限制阻碍了亚单位疫苗研制的进展。研究者们也开展了大量的研究来改善抗原的免疫保护效果,包括新佐剂的研制,益生菌诱导的非特异性免疫等,但是这些都不能从根本上改善抗原的免疫原性。因此,改善已有疫苗可能是一个快速和有效的方法。定向进化被广泛用于蛋白质工程领域,其中重要的应用之一就是改善抗原的免疫原性。关键氨基酸的改变对于抗原的免疫反应和免疫识别有很大影响,比如可逆抑制宿主的免疫反应、影响T细胞的激活、改善蛋白质免疫原性等,使用随机突变构建基因突变库是定向进化常用的方法之一。EtMIC家族蛋白质在球虫移行、入侵宿主细胞以及胞内生存方面有重要的作用,EtMIC2蛋白质能够在柔嫩艾美耳球虫的整个生活周期内都表达,研究表明EtMIC2基因或者蛋白质能够诱导部分免疫保护反应,是很好的疫苗候选抗原。使用随机突变技术针对EtMIC2进行定向进化,建立基因突变库,使用酵母表面展示技术结合FACS以及动物免疫保护试验筛选目的变异蛋白质,从而改善EtMIC2蛋白质的免疫原性,为球虫疫苗的研制提供基础。1.EtMIC2基因变异库的构建以未突变的EtMIC2基因为模板,使用epPCR进行扩增,获得约33μg的epPCR产物,与T1克隆载体连接后转入大肠杆菌细胞内。经323个氨苄抗性的琼脂平板筛选,获得107个E. coli单克隆。挑取每个平板上的20个单菌落进行PCR鉴定,6460个菌落中有5782个显示为阳性,阳性率达到89.5%。为分析epPCR的突变频率以及突变在基因中的分布,随机选择了阳性克隆中的21变异EtMIC2基因进行序列鉴定,经比对分析在951bp的变异基因中平均出现了6.86+3.21个突变位点,编码的蛋白质有4.19±2.68个氨基酸突变,而且突变位点在EtMIC2基因中随机分布,与我们之前的试验设计一致,结果证明EtMIC2基因突变库构建成功。2. EtMIC2蛋白质变异库的构建PCR扩增基因突变库中的EtMIC2片段,与pCTCON2质粒进行双酶切后连接并转染酿酒酵母EBY100,涂布SD-CAA筛选平板,获得大约为108个酵母克隆。经诱导表面展示后,以兔源抗EtMIC2蛋白质多抗作为一抗,FITC标记的鼠抗兔IgG单抗作为二抗标记展示的变异蛋白质,使用免疫荧光检测蛋白的表达情况。利用100mM DTT还原Agalp和Aga2p之间的二硫键,游离表面展示的变异蛋白,使用兔源抗EtMIC2蛋白质多抗进行Western blot鉴定,结果显示EtMIC2变异蛋白质库成功展示于酵母细胞表面。3.EtMIC2蛋白质变异库的筛选使用流式细胞分选仪对酵母表面展示的蛋白质突变库进行筛选,基于抗原抗体反应亲和力的强弱为筛选条件设三个筛选门(P1,P2和P3),经过三次连续的筛选从108个进样酵母菌中收集到401个具有不同荧光信号强度的细胞。将筛选的酵母菌涂布固体筛选SD-CAA平板,培养后获得19个酵母克隆菌落。为获得变异EtMIC2的基因序列,提取酵母菌中的重组质粒,经PCR扩增与T1载体连接后测序。经分析19个突变株中有5株蛋白质的氨基酸序列未发生突变,6株蛋白质出现终止密码子,剩余7株变异EtMIC2蛋白质分别有2,3,4,6,8,11和14个突变氨基酸。同时使用免疫荧光以及流式细胞仪检测19株变异蛋白质的荧光信号,并分析了与氨基酸突变的关系。4.变异EtMIC2蛋白质抗球虫感染的保护效果评价将EtMIC2以及7种变异基因克隆至pET30a表达质粒并转化大肠杆菌,经诱导表达以及纯化后获得高纯度的蛋白质,并使用鼠源抗His标签单抗进行Western blot进行鉴定。将变异蛋白质与弗氏佐剂乳化后制作亚单位疫苗,在雏鸡7和14日龄时进行颈部皮下多点注射免疫两次,二免后七天除不免疫不感染球虫组(PBS-Ⅰ)外皆接种30,000个柔嫩艾美耳球虫卵囊。结果显示相对于不免疫感染球虫组(PBS-Ⅱ),各蛋白免疫组的体重增长升高显著,卵囊排出以及病变积分均有显著性的降低(P<0.05)。与未突变的蛋白质免疫组相比,1130,2119以及2118组中盲肠病变记分以及1130组粪便的卵囊排出均显著降低,ACI结果显示1130和2119组变异蛋白质能够提供良好的保护力,而且2119以及1130免疫组的淋巴细胞针对EtMIC2和EtMIC2变异蛋白质的刺激后的增殖效果,感染球虫后第10天外周血淋巴细胞中CD4+和CD8+的比例,以及感染球虫第0,10天盲肠黏膜中的sIgA的抗体水平都显著增高(P<0.05)。试验结果表明变异后的EtMIC2蛋白质抗球虫的免疫保护效果得到显著改善,筛选到两株变异蛋白质(2119和1130)能够改善抗原的免疫原性以及免疫保护作用。表明通过随机突变改善球虫抗原的免疫原性以及免疫保护力是可行的,这是首次使用随机突变来改变寄生虫蛋白质的免疫原性。