肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是世界上第五大最常见的恶性肿瘤,每年约有100万以上的人新患此病和超过50万的人死于此病,占全球恶性肿瘤死亡原因的第3位,它也是我国最常见且恶性程度最高的肿瘤之一,位居我国癌症死亡原因的第2位。在过去的数十年里,细胞分子生物学的迅猛发展已大大深化了人们对HCC形成机制的理解,普遍认为HCC的发生是由于在肝炎病毒和其它致癌因素的作用下,肝细胞发生了基因突变或表观遗传改变而导致癌变。然而这些认识却未能给如何控制这一恶疾带来突破性的进展,主要原因之一以往对HCC的研究只把焦点放在肝细胞恶变上,却忽视了间质细胞在其中的重要作用。基因和细胞生物学的研究表明,实质细胞和间质细胞的共同作用是癌症形成和发展的重要基础。间质细胞包括活化的（肌）成纤维细胞、炎症细胞、内皮细胞等,通过细胞因子、化学因子、细胞外基质（extracellular matrix,ECM）或细胞间的直接接触等途径和实质细胞相互作用,与实质细胞癌变、肿瘤中新生血管及结缔组织生成、肿瘤免疫等有关,在肿瘤发生发展中扮演重要角色。肝脏的间质细胞包括肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）和枯否细胞等。HSC又称为Ito细胞、贮脂细胞（lipocyte）、窦周细胞（perisinusoidall cell）,呈梭形或多边形,位于肝窦内皮与肝细胞之间的Disse间隙内,其特点是具有长的分枝状的细胞突起,并通过这些细胞突起与肝窦内皮细胞和肝细胞形成紧密接触,为HSC和肝细胞的相互作用奠定了生理解剖学基础。正常时HSC占肝脏固有细胞总数的15%,作为储脂细胞主要参与体内维生素A的代谢,处于静止状态,不表达α—平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、低增殖活性、低合成胶原能力。在肝炎病毒和其它肝损因素的作用下,HSC可被激活,失去脂质,并发生形态学改变,转化为肌成纤维细胞。HSC活化的主要标志为细胞增殖、表达α-SMA、异常分泌一些细胞因子、化学因子以及合成以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的多种细胞外基质（ECM）蛋白,结果造成肝脏纤维化并进一步发展为肝硬化。因此,HSC活化已被认为是肝脏纤维化、肝硬化的关键环节。众所周知,HCC常在肝纤维化、肝硬化的基础上发展而来,提示HSC活化在HCC的发生中起了至关重要的作用,然而具体的作用机制仍然不详。肌细胞增强因子2（myocyte enhancer factor 2,MEF2）是最早在骨骼肌管核发现的蛋白质,是一种和肌细胞分化、发展相关的转录调节子,具有DNA的结合活性,在骨骼肌、心肌、平滑肌和神经系统的发育过程中介导细胞的分化。越来越多的研究发现,MEF2家族成员（MEF2A,-B,-C,和-D）不仅在肌细胞分化的基因活化中有着重要作用,也参与肌细胞分化以外的多种基因调节,涉及多样的基因表达和功能的调控机制,正日益受到高度的重视。近来有研究者从大鼠肝脏中分离出星状细胞,在体外培养的过程中,发现MEF2的mRNA和蛋白质水平均随着HSC的活化而逐渐升高。在动物实验模型中也发现,肝脏纤维化和MEF2的蛋白水平相关,MEF2的蛋白水平高则肝脏纤维化程度重。由此推测,MEF2可能在HSC调控肝硬化、肝癌发生的病理变化过程中扮演重要的角色。MEF2家族成员的N端都包含MADS/MEF2S位点,可以调控和DNA的结合以及和基因的相互作用。通过MADS/MEF2S位点,MEF2可以募集Ⅱ型组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases,HDACs）和/或乙酰基转移酶（histoneacetyltransferases,HATs）。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）和乙酰基转移酶（HATs）是调控组蛋白乙酰化状态的两种功能相反的酶,前者主要是移去核心组蛋白（H2A,H2B,H3和H4）N端赖氨酸残基上的乙酰基,使组蛋白低乙酰化;后者则将乙酰辅酶A上的乙酰基转移到核心组蛋白分子N端赖氨酸的ε-氨基上,进行乙酰化修饰,使组蛋白高乙酰化。研究发现,多种肿瘤中存在HATs/HDACs的异常募集,组蛋白呈高/低乙酰化状态,而组蛋白乙酰化状态失衡使基因的正常转录表达受到影响,导致了肿瘤的发生。不同肿瘤其组蛋白乙酰化状态也各不相同,有些肿瘤呈现组蛋白高乙酰化,而有些则表现为低乙酰化,主要与其参与调控的基因有关。目前,以调整组蛋白乙酰化状态为治疗靶点的癌症化疗药物包括HDACs抑制剂和HATs抑制剂特别是HDAC抑制剂的研发正在蓬勃开展。大量体外研究发现应用HDACs抑制剂可以阻滞肿瘤细胞周期,抑制其生长,诱导其分化和/或凋亡。HDACs抑制剂已被美国FDA批准用于白血病的治疗,在实体瘤治疗中的应用处于临床试验阶段。但是也有研究结果提示,HDAC基因的低表达状态与癌症的不良预后相关。如在乳腺癌中,HDAC6 mRNA和蛋白质水平在直径小于2cm、雌激素受体和孕激素受体阳性的肿瘤组织中呈高表达,其高表达状态与乳腺癌患者的无瘤生存率及内分泌治疗的有效性呈正相关。另外,有人报道Ⅱ型HDAC基因表达水平的下降与肺癌患者的不良预后显著相关,是一个独立的不良预后预测指标,尤其是HDAC10。依据这些研究结果,试图使用HDACs抑制剂作为抗癌药,通过提高细胞组蛋白的乙酰化水平来治疗乳腺癌和肺癌等实体肿瘤,前景不容乐观。迄今为止,国内外尚未对肝癌中HDACs/HATs的表达状态、组蛋白乙酰化水平进行系统、详尽的研究。人们直接尝试应用HATs抑制剂或HDACs抑制剂改变组蛋白乙酰化状态以治疗肝癌,结果体外研究发现两者都有潜在的抗癌作用。HATs抑制剂如姜黄素（Cur）,镍离子和1,10-二氮杂菲铜(1,10-phenanthroline-Cu²⁺)可下调抗凋亡基因表达、抑制肝癌细胞生长、导致肝癌细胞凋亡;另外的研究却支持HDACs抑制剂对肝癌细胞的抑制作用,其机制有:1)阻滞肝癌细胞周期,抑制细胞生长、增殖,上调抑制细胞周期的基因,诱导凋亡;2)恢复多个抑癌基因的表达;3)降低肝癌细胞的端粒酶活力,抑制肝癌细胞增殖;4)通过NK细胞介导的免疫反应,破坏肝癌细胞。互相矛盾的体外研究结果,促使我们有必要进一步了解:（1）肝癌组织中的组蛋白乙酰化水平及其调节酶的表达,以期为以改变组蛋白乙酰化状态为治疗靶点的新的抗癌药物在肝癌中的应用提供科学依据;（2）肝癌发生过程中组蛋白乙酰化异常是否与MEF2有关。因此,本实验观察人正常肝组织、肝硬化和原发性HCC组织中HSC的活化情况、检测MEF2和Ⅱ型HDACs（HDAC4,-5,-6,-7,-9,-10）基因的表达、分析组蛋白乙酰化状态,致力于探索HCC发生过程中组蛋白乙酰化的异常变化,探讨活化的HSC通过MEF2,募集ⅡHDACs/HATs,调节组蛋白乙酰化修饰水平,从而在HCC发生中发挥重要作用的可能机制。材料与方法病例和组织标本本研究使用人三种肝脏组织标本共75例,包括HCC组织（n=35）、肝硬化组织（n=20）、正常肝组织（n=20）。HCC组织取自35位因原发性HCC在浙江大学医学院附属第一医院肝胆胰外科暨肝移植中心行肝切除或肝移植手术的患者,肝硬化组织取自因肝硬化在我院行肝移植手术时切除的病肝（n=20）,正常肝组织取自20位意外死亡的患者。HCC和肝硬化患者都是乙肝病毒感染者。新鲜获取的肝组织标本,部分放入液氮容器中快速冷冻,后移至冻存管中置于—80℃冰箱保存;部分由10%福尔马林溶液固定过夜,经过脱水,石蜡包埋。诊断均经病理证实并结合实验室检查。第一部分HCC和肝硬化组织中HSC的活化情况1、构建一个包含原发性HCC（n=35）、肝硬化（n=20）、正常肝组织（n=20）的组织芯片,应用抗α-SMA抗体通过免疫组化的方法识别活化的HSC2、采用单盲法由经验丰富的病理医生判断免疫组化染色结果,活化的HSC呈星形、梭形或纺垂形,α-SMA染色阳性;血管区、Glisson鞘、纤维间隔内的染色阳性细胞不在分析之列3、比较HCC、肝硬化、正常肝组织中HSC的活化情况第二部分HCC、肝硬化、正常肝组织中的MEF2表达1、荧光实时定量PCR方法检测HCC（n=35）、肝硬化（n=18）、正常肝组织（n=17）中MEF2 A、MEF2C的mRNA表达2、Western blot测定HCC（n=20）、肝硬化（n=20）、正常肝组织（n=20）中MEF2A、MEF2C的蛋白表达3、比较分析HCC、肝硬化、正常肝组织中MEF2表达差异第三部分HCC、肝硬化、正常肝组织中ⅡHDACs的表达和组蛋白乙酰化状态1、荧光实时定量PCR方法检测HCC（n=35）、肝硬化（n=18）、正常肝组织（n=17）中ⅡHDACs（HDAC4,-5,-6,-7,-9,-10）的mRNA表达2、Western blot测定HCC、肝硬化、正常肝组织中ⅡHDACs（HDAC4,-5,-6,-7,-9,-10）的蛋白表达3、Western blot检测HCC（n=20）、肝硬化（n=20）、正常肝组织（n=20）中组蛋白乙酰化H3、H4的蛋白表达,判断乙酰化状态4、利用第一部分构建的组织芯片,应用抗乙酰化组蛋白H3（Lys 9）、H4（Lys 8）的多克隆抗体采用免疫组织化学染色法检测HCC、肝硬化、正常肝组织中乙酰化组蛋白H3（Lys 9）、H4（Lys 8）的表达,细胞核呈棕色的是阳性细胞5、统计分析HCC、肝硬化、正常肝组织中MEF2A、MEF2C表达和ⅡHDACs（HDAC4,-5,-6,-7,-9,-10）表达以及和组蛋白乙酰化水平的相关性结果一、HCC和肝硬化组织中HSC活化明显增强1、活化的HSC即α-SMA染色阳性、形状为星形、梭形或纺垂形在HCC和肝硬化组织中明显比正常肝组织增多2、排除血管区、Glisson鞘、纤维间隔内免疫染色呈阳性的细胞后,发现HCC和肝硬化组织中活化的HSC的分布也明显不同,活化的HSC遍布于HCC的瘤体内和瘤体周围,在肝硬化组织中只分散在肝窦周围二、HCC中MEF2表达增强1、定量PCR结果显示,MEF2A、MEF2C mRNA表达在HCC中明显比肝硬化和正常肝组织高（P＜0.05）,肝硬化和正常肝组织相比虽没有统计学意义（P＞0.05）,但有增高趋势2、Western blot证实MEF2A、MEF2C的蛋白表达在正常肝脏、肝硬化和HCC中逐渐递增（P＜0.05）三、HCC中ⅡHDACs表达上调1、HCC中ⅡHDACs（HDAC4,-5,-6,-7,-9,-10）mRNA水平比在肝硬化和正常肝组织高（P＜0.05）,而肝硬化和正常肝组织相比有增高趋势,但没有统计学意义（P＞0.05）2、HDAC4,-5,-6,-7,-10蛋白表达在正常肝组织很弱,在肝硬化和HCC中递增（P＜0.05）四、HCC中组蛋白H3、H4呈高乙酰化1、Western blot证实HCC中乙酰化组蛋白H3、H4的蛋白表达明显比肝硬化和正常肝组织强（P＜0.05）2、应用抗乙酰化组蛋白H3（Lys 9）、H4（Lys 8）多克隆抗体的免疫组化结果显示,核棕染的阳性细胞在HCC中最丰富、肝硬化次之,正常肝组织中最少,说明组蛋白H3、H4的乙酰化水平在HCC中最高,肝硬化次之,正常肝组织最低五、MEF2的表达和ⅡHDACs以及乙酰化组蛋白H3、H4表达水平密切相关（相关系数大于0.5）结论一、肝脏由正常向肝硬化转变并最终发展为肝癌的过程中,HSC活化,MEF2表达逐渐增强,同时伴有Ⅱ型HDACs的表达上调和组蛋白的乙酰化程度升高二、HCC中ⅡHDACs高表达和组蛋白高乙酰化与MEF2的表达密切相关三、活化的HSC在HCC发生中发挥重要作用的可能机制是通过MEF2,募集ⅡHDACs/HATs,破坏HDACs/HATs的动态平衡,引起组蛋白乙酰化状态失调,从而促使HCC的发生四、干预HSC-MEF2-HDAC/HAT通路可能为肝癌防治提供新的策略