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目的研究益气解毒方(Qi-Boosting Toxin-Resolving Formu,QBTRF)对人鼻咽癌CNE-2Z细胞自噬和凋亡的影响,并初步探讨CNE-2Z细胞自噬和凋亡之间的关系。方法1.QBTRF诱导CNE-2Z细胞凋亡的检测采用MTT法检测不同浓度QBTRF干预鼻咽癌CNE-2Z细胞24h和48h后细胞存活率,计算出48h的IC50(半数抑制率浓度);Annexin V-FITC/PI双染检测QBTRF作用12h、24h、36h和48h后细胞凋亡率及使用Z-VAD-fmk(细胞凋亡抑制剂)后细胞凋亡率;选用Western Blot法检测QBTRF干预CNE-2Z细胞12h、24h、36h和48h后Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2和Cleaved PARP蛋白表达、使用Z-VAD-fmk后Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2和Cleaved PARP蛋白表达2.QBTRF诱导CNE-2Z细胞自噬的检测通过MDC染色检测QBTRF作用CNE-2Z细胞12h、24h、36h和48h后自噬体的形式;Western Blot检测QBTRF干预CNE-2Z细胞12h、24h、36h和48h后LC3、Beclin1蛋白表达、使用3-MA(细胞自噬抑制剂)后LC3、Beclin1及PI3K/Akt/m TOR信号通路相关蛋白表达。3.细胞自噬和凋亡的相关性研究透射电镜下观察QBTRF干预后细胞内自噬体和凋亡小体;Annexin V-FITC/PI双染检测使用3-MA后CNE-2Z细胞凋亡率的变化;Western Blot检测使用Z-VAD-fmk后LC3和Beclin1蛋白表达的变化。结果1.QBTRF对CNE-2Z细胞增殖的影响MTT结果显示,QBTRF显著抑制CNE-2Z细胞增殖,并且抑制效应呈时间依赖性和浓度依赖性。QBTRF干预CNE-2Z细胞24h后,0.25、0.5、1、2mg.m L-1细胞存活率分别为(74.39±1.94)%、(64.23±0.78)%、(54.35±1.57)%、(33.90±1.52)%和(20.92±1.56)%,与Control组相比,差异均有统计学意义(p值均(27)0.01);干预48h后,细胞存活率分别为(67.34±0.36)%、(47.67±0.30)%、(36.93±7.18)%、(22.78±1.02)%和(14.54±0.22)%,与Control组相比,差异均有统计学意义(p值均(27)0.01)。2.QBTRF对CNE-2Z细胞凋亡的影响(1)Annexin V-FITC/PI双染结果显示,0.5mg.m L-1 QBTRF处理CNE-2Z细胞12h、24h、36h和48h后细胞凋亡率分别为(38.69±3.22)%,(54.30±6.93)%,(69.53±4.14)%和(80.87±4.15)%,与Control组(1.11±0.83)%相比,差异均具有统计学意义(P值均(27)0.01)。10μM Z-VAD-fmk预处理显著降低QBTRF诱导的细胞凋亡率,Z-VAD-fmk预处理+QBTRF组凋亡率为(14.30±3.07)%,QBTRF组凋亡率(58.66±5.66)%,差异有统计学意义(p(27)0.01)。单纯使用Z-VAD-fmk组(2.02±0.50)%与Control组(1.39±0.58)%相比,差异无统计学意义(p(29)0.05)。(2)Western Blot结果表明,0.5mg.m L-1 QBTRF干预CNE-2Z细胞不同时间(12h、24h、36h和48h)后,Cleaved caspase-3、Bax和Cleaved PARP蛋白表达上调,而Bcl-2蛋白表达下降,与Control组比较,差异均具有统计学意义(p值均(27)0.01);Z-VAD-fmk预处理+QBTRF组Cleaved caspase-3、Bax和Cleaved PARP蛋白表达下降,Bcl-2的表达上调,与QBTRF组相比,差异有统计学意义(p(27)0.05和p(27)0.01)。3.QBTRF对CNE-2Z细胞自噬的影响(1)MDC结果显示,QBTRF作用于CNE-2Z细胞后荧光强度增加,药物干预12 h、24 h、36 h和48h后荧光强度分别为(0.044±0.009)、(0.078±0.010)、(0.053±0.010)和(0.030±0.007),与Control组比较(0.011±0.008),差异均有统计学意义(p(27)0.05和p(27)0.01)。(2)Western Blot结果显示,QBTRF干预CNE-2Z细胞12 h、24 h、36 h和48h后,LC3-II、Beclin1蛋白表达较Control组增强,差异均具有统计学意义(p(27)0.05和p(27)0.01);干预24h时,LC3-II,Beclin1蛋白表达水平最高。此外,干预24h时,QBTRF组的PI3K,p-AKT,p-m TOR蛋白表达较Control组下调(p(27)0.05和p(27)0.01),与QBTRF组相比,3-MA预处理+QBTRF组LC3-II、Beclin1表达下调(p(27)0.05和p(27)0.01),PI3K,p-AKT,p-m TOR蛋白表达上调(p(27)0.05和p(27)0.01)。4.CNE-2Z细胞自噬与凋亡的相关性研究(1)透射电镜结果显示,QBTRF干预CNE-2Z细胞12 h后细胞内出现少量自噬体,细胞结构完整清楚;干预24h后,细胞内自噬体明显增多,细胞核开始出现固缩;干预36h后,细胞内自噬体数量相对减少,细胞核明显固缩,胞浆内空泡增多;干预48h后,细胞内自噬体减少,核固缩成块,细胞体积缩小并有出芽现象。(2)Annexin V-FITC/PI双染结果表明,3-MA抑制QBTRF诱导的CNE-2Z细胞凋亡。与Control组(1.66±0.76)%比较,3-MA组凋亡率为(1.97±0.68)%,差异无统计学意义(p=0.879);与QBTRF组凋亡率(54.79±4.06)%比较,3-MA预处理+QBTRF组的细胞凋亡率(19.40±2.59)%显著下降,差异有统计学意义(p=0.000)。(3)Western Blot结果显示,与QBTRF组比较,自噬抑制剂3-MA预处理+QBTRF组的凋亡蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved PARP和Bax表达水平下降,而凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达水平则上调,差异均有统计学意义(p值均(27)0.01);与QBTRF组比较,凋亡抑制剂Z-VAD-fmk预处理+QBTRF组自噬相关蛋白LC3和Beclin1蛋白表达显著下降,差异均有统计学意义(p(27)0.05)。结论QBTRF抑制人鼻咽癌CNE-2Z细胞增殖并诱导细胞凋亡和自噬,其诱导细胞自噬与激活PI3K/AKT/m TOR通路有关;QBTRF诱导的细胞自噬可以促进细胞凋亡。