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背景:血小板表面P2Y12受体激活是ACS和PCI术后血小板活化和聚集的关键通路。因此,P2Y12受体拮抗剂联合阿司匹林(DAPT)是ACS和PCI术后血栓防治的基石。虽然新型P2Y12受体拮抗剂(如:替格瑞洛)已经应用于临床,但是经典的P2Y12受体拮抗剂氯吨格雷仍然是ACS和PCI术后抗栓治疗的一线药物。由于氣峨格雷抗血小板反应性存在个体差异,因此,如何安全有效的个体化应用氯毗格雷抗血小板治疗仍然是临床亟待解决的难题。前期表观遗传学研究发现,血小板microRNAs参与血小板活化,进而可能影响抗栓药物反应性。但是关于血小板microRNAs与P2Y12受体拮抗剂氣咐格雷抗栓反应性个体差异的相关性尚不明确,且缺乏相关机制的研究报道。本课题拟对血小板microRNAs与P2Y12受体拮抗剂氣吡格雷抗血小板反应性的相关性进行分析;在此基础上,分析血小板miR-126功能性基因型与ACS患者氯吡格雷抗血小板反应性的关联性研究;并深入阐述miR-126调控P2Y12受体拮抗剂氣吡格雷抗血小板反应性的药物表观遗传学机制。第一部分血小板microRNAs与P2Y12受体拮抗剂氣吡格雷抗血小板反应性的相关性分析目的:探讨血小板源性microRNAs与P2Y12受体拮抗剂氣吡格雷抗血小板反应性个体差异的相关性。方法:连续募集健康志愿者以及经氣吡格雷抗血小板治疗的ACS患者,应用血栓弹力图(TEG)检测血小板反应性,根据检测指标ADP诱导的血小板纤维蛋白凝块强度(TEG-MAADP),分别在健康志愿者和口服氣吡格雷的ACS患者中筛选出血小板反应性呈极端高反应性和极端低反应性者各10例。通过荧光定量PCR技术,首先在健康志愿者中筛查与血小板反应性相关的血小板候选miRNAs,然后在ACS患者中验证上述筛查获得的血小板候选miRNAs与氣吡格雷抗血小板反应性的相关性。结果:总计募集214例健康志愿者和430例经氯吡格雷抗栓治疗的ACS患者。在健康志愿者中筛查获得血小板miR-223,miR-130,miR-126及miR-150表达水平与血小板反应性存在显著的相关性(P≤0.03)。在氣吡格雷治疗的ACS患者中的验证发现,miR-223和miR-126在血小板反应性呈极端高反应性(HTPR)的患者中的表达明显低于血小板反应性呈极端低反应性(LTPR)的患者,(miR-223:0.68±0.10 vs.0.34±0.10,p=0.04;miR-126:5.94±1.13 vs.1.27±0.23,P<0.01)。miR-150 在 HTPR 患者中的表达明显高于 LTPR 的患者(miR-150:0.99±0.14vs.1.60±0.18,p=0.02)。而 miR-130 在两组患者中的表达未见明显差异。结论:血小板源性miR-126、miR-223、miR-150与ACS患者氣吡格雷抗血小板反应性个体差异有关。第二部分血小板miR-126功能性基因型与ACS患者氯峨格雷抗血小板反应性的关联性研究目的:探索血小板活性相关的miR-126功能性基因单核苷酸多态性(SNP)与ACS患者氣峨格雷抗血小板反应性的关联性。方法:连续募集经氣吡格雷抗血小板治疗的ACS患者,应用血栓弹力图(TEG)检测血小板反应性。根据TEG-MAADP>47及ADP抑制率<30%的标准,筛选出血小板高反应性(HTPR)组;TEG-MAADP<31及ADP抑制率>90%的标准,筛选出血小板低反应性(LTPR)组。提取两组患者外周血DNA,对miR-126(rs4636297)功能基因位点进行分型,分析该基因型与氣吡格雷抗血小板反应性的相关性。结果:总计连续募集了 364名经氯吡格雷抗血小板治疗的ACS患者,根据血栓弹力图检测结果,共有193例患者入选HTPR组,171例患者入选LTPR组。单因素分析显示,在HTPR组中,携带miR-126相关等位基因rs4636297 AG+AA型的比例明显高于 LTPR 组((37.3%vs.23.4%,HR:1.949,95%CI:1.232-3.083,P=0.004)。通过校正性别、年龄、吸烟、高血压、糖尿病、CYP2C19*2/*3因素后,经过多因素Logistic回归分析发现,在HTPR组中,携带miR-126相关等位基因rs4636297 AG+AA型的比例仍明显高于 LTPR 组(HR:1.581,95%CI:1.012-2.470,P=0.04)。结论:miR-126的功能性基因型rs4636297与ACS患者中氣吡格雷治疗期间高血小板反应性具有关联性,进一步提示,miR-126可能通过参与血小板活化,影响氯吡格雷抗血小板反应性。第三部分miR-126调控P2Y12受体拮抗剂氯吡格雷抗血小板反应性的药物表观遗传学机制目的:探索miR-126对P2Y12受体拮抗剂氣吡格雷抗血小板下游通路上的靶基因PI3KR2的靶向调控作用。方法:首先人源性骨髓巨核细胞系(MEG-01)中过表达miR-126,利用荧光定量PCR技术检测PI3KR2 mRNA表达量的变化。构建PI3KR2 3’UTR端野生型及突变型质粒,并将其构建到psiCHECK2双荧光素酶报告载体中,转染293T细胞,通过荧光素酶报告基因系统检测miR-126是否能够与PI3KR2靶向结合。结果:在MEG-01细胞中过表达miR-126能够显著降低PI3KR2的表达水平,而下调miR-126表达水平后,PI3KR2的表达水平显著提升高(P<0.05)。在293T细胞系中,转染miR-126和PI3KR2野生型报告质粒组的相对荧光素酶活性较明显低于miR-126和PI3KR2突变型报告质粒组(P<0.01),提示miR-126是否能够与PI3KR2靶向结合。结论:miR-126可能通过靶向调控氣吡格雷抗血小板下游通路上的PI3KR2基因表达,进而影响氣吨格雷抗血小板反应性的个体间差异。