目的:研究不同制备工艺对浒苔多糖(Enteromorpha’s polysaccharide,EP)初级结构的影响;研究浒苔多糖分离纯化的条件;研究不同制备工艺所得浒苔多糖降血糖的作用;研究浒苔多糖初级结构与其降血糖作用的关系。方法:1、以福建沿海所产浒苔为实验材料,分别采用超声波辅助制备法或纤维素酶法制备浒苔多糖,两者多糖提取液,均通过离心去渣,通过中性蛋白酶去除蛋白质,通过透析袋去除盐类物质,通过DA201树脂去除色素后,采用醇沉法结合冻干工艺得到超声波法制备的浒苔粗多糖UEP(EP by ultrasonic)和纤维素酶法制备的浒苔粗多糖EEP(EP by enyzme)。2、采用DEAE-52纤维素和Sephadex-100凝胶分离纯化浒苔粗多糖,得到UEP的主成分UEP1和EEP的主成分EEP1。对UEP1和EEP1进行结构分析,用液相色谱分析分子量,用气相色谱分析单糖组成,用红外线光谱分析功能团;用苯酚硫酸法测定多糖含量,用硫酸钡比浊法测定硫酸根含量,用间羟基联苯法测定糖醛酸含量。3、以Hep G2细胞为实验对象,采用胰岛素和二甲双胍作为阳性对照组,观察UEP1和EEP1是否能降低葡萄糖。4、建立胰岛素抵抗模型,采用二甲双胍作为阳性对照组,观察UEP1和EEP1是否能降低培养基内葡萄糖含量,并通过逆转录多聚酶链式反应(RTPCR)测定肝细胞核因子(HNFs)家族、胰岛素受体(IR)和葡萄糖转运体(GLUTs)家族mRNA的表达水平。结果:1、浒苔多糖的制备及分离纯化uep和eep均为淡绿色粉末状固体,不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂。水溶性较差,在水中的最大溶解度为40mg/ml。uep、eep经分离纯化,均得到五个组分,且都以第一个组分为主成分。uep五个组分摩尔比为146:27:40:3:1,主成分uep1占uep的67.28%,回收率为98.85%;eep五个组分摩尔比为89:18.5:27:8.5:1,主成分eep1占eep的61.80%。回收率为99.12%。uep1和eep1均为白色粉末状固体,不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂。uep1、eep1较uep、eep水溶性降低,在水中的最大溶解度为20mg/ml。浒苔多糖水溶液可形成凝胶,且这种溶液——凝胶的转变现象是热可逆的。2、浒苔多糖结构和成分分析uep1和eep1均是α-吡喃型多糖,富含硫酸基团,不含蛋白质,且含有糖醛酸、羧酸、醚键;含有鼠李糖(rha)、木糖(xyl)、甘露糖(man)、葡萄糖(glu)、半乳糖(gal),以rha含量最高。但uep1和eep1的初级结构不完全相同。uep1中rha、xyl、man、glu、gal的摩尔比为3.96:1.09:0.24:0.34:0.16;eep1中rha、xyl、man、glu、gal的摩尔比为3.08:1:0.17:0.30:0.11。uep1平均分子量为179547,eep1平均分子量为520160。uep1多糖含量为98.59%,eep1为97.09%。uep1硫酸根含量为17.74%,eep1为20.71%。uep1糖醛酸含量为22.20%,eep1为21.76%。3、不同制备工艺的浒苔多糖降血糖效果及机制研究hepg2细胞葡萄糖消耗试验结果,与空白组(blank)比较,阳性对照组1(即胰岛素组,insulin)、阳性对照组2(二甲双胍组,metformin)、uep1由高到低四个剂量组(huep1、muep1、luep1、suep1)、eep1由高到低四个剂量组(heep1、meep1、leep1、seep1)均较高(p<0.05);与阳性对照组metformin比较,blank、luep1、suep1、seep1的葡萄糖消耗量(gc)较低(p<0.05),insulin、heep1、meep1的gc较高(p<0.05);与阳性对照组insulin组比较,blank、metformin、muep1、luep1、suep1、seep1的gc较低(p<0.05),meep1的gc较高(p<0.05)。比较uep1降血糖最佳浓度huep1与eep1降血糖最佳浓度meep1,发现meep1降血糖效果优于huep1,差别有统计学意义(p<0.05)。实验建立了胰岛素抵抗模型,以1×10-3mmol/l胰岛素作用36小时后开始产生胰岛素抵抗,60小时内模型稳定。油红o染色可见胰岛素抵抗模型鲜红色脂滴明显增多。实验发现与空白对照组blank比较,模型组(model)、uep1各剂量组、eep1各剂量组的gc较低(p<0.05);与模型组model比较,其它组gc均较高(p<0.05);与阳性对照组metformin比较,model、huep1、muep1、luep1、suep1、leep1、seep1的gc较低(p<0.05)。比较uep1降血糖最佳浓度huep1与eep1降血糖最佳浓度heep1,发现heep1降血糖效果优于huep1,差别有统计学意义(p<0.05)。观察uep1和eep1各基因的表达量:①hnf4α:与blank比较,各实验剂量组均较低(p<0.05);与模型组model对比,各实验剂量组均较高(p<0.05);与阳性对照组metformin对比,muep1、luep1、suep1、meep1、leep1、seep1表达量较低。②hnf1α:与blank对比,各实验剂量组均较低(p<0.05);与模型组model对比,metformin、huep1、muep1、heep1、meep1、leep1表达量较高(p<0.05);与阳性对照组metformin对比,muep1、luep1、suep1、leep1、seep1表达量较低(p<0.05)。③hnf1β:与blank对比,各实验剂量组均较低(p<0.05);与模型组model对比,metformin、huep1、muep1、luep1、heep1、meep1、leep1、seep1表达量较高(p<0.05);与阳性对照组metformin对比,muep1、luep1、suep1、meep1、leep1、seep1表达量较高(p<0.05)。④hnf6:与blank对比,各实验剂量组均较低(p<0.05);与模型组model对比,各实验剂量组均较高(p<0.05);与阳性对照组metformin对比,luep1、suep1、meep1、leep1、seep1表达量较低(p<0.05)。⑤ir:与blank对比,在各实验剂量组均较低(p<0.05);与模型组model对比,各实验剂量组均较高(p<0.05);与阳性对照组metformin对比,heep1表达量较高,luep1、suep1、leep1、seep1表达量较低(p<0.05)。⑥glut4:与blank对比,各实验剂量组均较低(p<0.05);与模型组model对比,实验剂量组均较高(p<0.05);与阳性对照组metformin对比,huep1、muep1、heep1表达量较高(p<0.05)。⑦glut2:与blank对比,各实验剂量组中均较高(p<0.05);与模型组model对比,各实验剂量组均较高(p<0.05);与阳性对照组metformin对比,ep各剂量组表达量均较低(p<0.05)。比较uep1和eep1各基因表达量:对比hnf6中uep1最佳浓度huep1与eep1最佳浓度heep1,huep1优于heep1(p<0.05),对比ir中uep1最佳浓度heep1与eep1最佳浓度huep1,heep1优于huep1(p<0.05)。其余hnf4α、hnf1α、hnf1β、glut4、glut2中uep1最佳浓度与eep1最佳浓度差别无统计学意义(p>0.05)。结论:1、两种不同制备工艺对浒苔多糖的初级结构及其降血糖作用均有一定的影响,但其主体结构和主要功能无变化。2、uep和eep分离纯化后均可分为五个组分,以第一组分为主。uep1和eep1均是α-吡喃型多糖,富含硫酸基团,是由不同大小多糖分子组成的混合体。两者均以rha为主,还有xyl、man、glu、gal。但其结构并不完全相同,uep1平均分子量小于eep1;uep1含有rib、fuc,而eep1没有,且单糖摩尔构成比不同;uep1多糖含量高于eep1;硫酸根含量低于eep1;糖醛酸含量高于eep1。3、采用胰岛素1×10-3mmol/l作用于hepg2细胞36h建立胰岛素抵抗模型,经油红o染色鉴定,模型细胞鲜红色脂滴增多,正常细胞仅见少量脂滴。rt-pcr结果显示hnfs、ir、glut4表达量下调,glut2表达量上调,模型在60h内稳定,可用于研究药物对2型糖尿病的作用。4、UEP1和EEP1均具有降血糖的功效,且作用效果可能优于胰岛素、二甲双胍。在实验剂量范围内,EEP1降血糖的作用优于UEP1,这可能与EEP1的分子量大于UEP1有关,可能与其能够更多的上调胰岛素受体的数目有关。5、EP改善胰岛素抵抗模型可能的机制有:①通过上调肝细胞核因子HNFs的表达量;②通过上调IR的表达量;③通过上调GLUT4的表达量;④通过下调GLUT2的表达量。