病毒性肝炎是由肝炎病毒引起的传染病，迄今公认可分为甲、乙、丙、丁、戊五种型别，其传染性较强，传播途径复杂，发病率高。我国是病毒性肝炎的高发区，在法定报告传染病中，病毒性肝炎的发病率占首位。乙型肝炎是由乙型肝炎病毒感染所导致的常见传染病之一，广泛流行于世界各国，我国是乙型肝炎的高发地区，乙型肝炎病毒感染率高达57.6％，乙肝表面抗原携带率约为9.8％，已成为我国极为突出的公共卫生问题。戊型肝炎是一种经粪口途径传播的急性传染病，在世界各地发展中国家广泛流行，严重危害人类健康。我国是戊型肝炎的高发区，1986年9月～1988年4月我国新疆南部地区发生戊型肝炎大流行，有近12万人发病，死亡5700余人，是迄今为止世界上最大的一次戊型肝炎大流行。尽管戊型肝炎不引起慢性化，但该病在普通人群的病死率约为0.4.％，在高龄人群和原有慢性肝病的人群中，其病死率较高，在孕妇中戊型肝炎的死亡率可高达20％。 乙型肝炎疫苗自从1970年第一代血源性乙肝疫苗到1986年重组乙肝疫苗获准使用以来，大量国内外临床实践证明，是预防乙型肝炎的安全有效措施。目前HEV疫苗尚未最终研制成功，然而，随着分子生物学技术的不断发展，用基因工程手段表达HEV主要结构蛋白作为HEV疫苗已成为研究的主要方向。本实验室以往应用抗原mapping技术和基于.PCR的体外中和实验发现HEV的中和抗原表位位于HEV ORF2编码蛋白C端的第452-617位氨基酸之间，在此基础上，采用原核表达系统，表达含有HEV中和抗原表位的HEV重组蛋白---p179，动物实验表明，该蛋白可诱导出高滴度的抗-HEV中和抗体，具有良好的免疫原性。最近的灵长类动物实验证明p179诱导的免疫应答能有效阻断HEV对免疫动物的致病性。 联合疫苗是含有两种或两种以上抗原，能够预防两种或两种以上疾病的疫苗制品，以其方便、多效、低成本成为新一代疫苗研究的热点。与单价疫苗相比，联合疫苗具有简化免疫程序，减少注射次数，提高疫苗覆盖率，减少交叉感染机会，便于数据的采集存档以及降低疫苗的运输、储存及冷链保存等环节的费用等诸多优点，因此具有显著的优越性。百日咳-白喉-破伤风三联疫苗在计划免疫中已使用多年即为一成功之例，近年来一些新的联合疫苗如甲乙肝联合疫苗也已经成功上市。由于各型肝炎病毒之间没有交叉免疫，同一个体可以感染两种或两种以上肝炎病毒。多重肝炎病毒感染较单一病毒感染的病情重，临床愈后较差。因此，研发更多的病毒性肝炎联合疫苗对有效控制病毒性肝炎有重要意义。鉴于联合疫苗的诸多优点以及我国HB、HE高度流行，重叠感染率不断增加的现状，我们开展了实验性乙型肝炎-戊型肝炎联合疫苗的研究，结果表明，联合疫苗具有良好的免疫原性。本研究主要分为以下2个部分： 一交叉剂量配比的实验性乙型肝炎。戊型肝炎联合疫苗的免疫原性研究本研究采用9种不同剂量配比的实验性乙型肝炎-戊型肝炎联合疫苗B5+E10、B5+E5、B5+E2.5、B2.5+E10、B2.5+E5、B2.5+E2.5、B1.25+E10、B1.25+E5和B1.25+E2.5(μg/0.5ml)分别免疫9组小鼠，同时以3种不同剂量的单价乙肝疫苗5μg、2.5μg、1.25μg以及3种不同剂量的实验性戊肝单价疫苗10μg、5μg、2.5μg免疫作为对照，采用间接ELISA法检测小鼠血清特异性抗体。探讨联合疫苗中乙肝抗原和重组HEV p179抗原两种组分问的相互作用。 研究证实，三个不同剂量乙肝单价疫苗对照组B5、B2.5、B1.25小鼠血清抗-HBs滴度在整个实验过程中均无显著性差异。三个不同剂量实验性戊肝单价疫苗E10、E5和E2.5组小鼠产生的抗-HEV抗体的水平在整个实验过程中也无明显区别。相同剂量的戊肝抗原与不同剂量的乙肝抗原配比制备的实验性乙肝-戊肝联合疫苗，诱导小鼠产生的抗-HBs抗体水平在整个实验过程中无明显区别。相同剂量的乙肝抗原与不同剂量的戊肝抗原配比制备的实验性乙肝一戊肝联合疫苗，诱导小鼠产生的抗-HEV抗体的水平在整个实验过程中也无显著差异。表明无论单独使用或联合使用乙肝、戊肝抗原，在一定范围内抗体滴度与该抗原剂量均无明显量效关系。然而，通过比较相同剂量的乙肝抗原与不同剂量的戊肝抗原配比制备的联合疫苗诱导小鼠产生的抗-HBs抗体的水平，观察联合疫苗中不同剂量戊肝抗原成分对乙肝抗原免疫原性的影响，结果显示B5+E5、B5+E2.5、B2.5+E5、B2.5+E2.5、B1.25+E10、B1.25+E5和B1，25+E2.5组乙肝、戊肝抗原比例适合，乙肝抗体滴度较高，与单价疫苗无显著差异。进一步比较相同剂量的戊肝抗原与不同剂量的乙肝抗原配比制备的联合疫苗诱导小鼠产生的抗-HEV抗体的水平，判断联合疫苗中不同剂量乙肝抗原成分对戊肝抗原免疫原性的影响，发现B1.25+E10、B5+E5、B2.5+E5、B1.25+E5和B2.5+E2.5组两种抗原比例适当，戊肝抗原均具有较好的免疫原性，与单价疫苗无显著差异。因此，最后得到了几个免疫效果较好的联合疫苗组B1.25+E10、B5+E5、B2.5+E5、B1.25+E5和B2.5+E2.5，并从中选取了B5+E5配比，进行了更深入的免疫原性方面的研究。二优选剂量配比的实验性乙型肝炎.戊型肝炎联合疫苗的免疫原性究我国HBV及HEV的感染率较高，相当一部分人通过隐性感染、亚临床感染或疫苗接种已产生了对该两种抗原的免疫，那么机体已经存在的抗-HBs及抗-HEV特异性抗体会不会影响实验性乙肝-戊肝联合疫苗的免疫原性?本实验第二部分针对这一问题进行了研究。我们采用预先给小鼠注射乙肝或戊肝疫苗的方法使部分小鼠产生抗-HBs及抗-HEV特异性抗体，建立预先存在抗体的小鼠动物模型。将建立好的小鼠模型、未经处理的与小鼠模型同一批次的BALB/c小鼠分为5组，即联合疫苗组、单价戊肝疫苗组、单价乙肝疫苗组、预先存在戊肝抗体小鼠注射联合疫苗组、预先存在乙肝抗体小鼠注射联合疫苗组，分别命名为B5+E5、 E5、B5、B5+E5(anti-HEV<+>)、B5十E5(anti-HBs<+>)。初次免疫时B5+E5、 B5+E5(anti-HEV<+>)、B5+E5(anti-HBs<+>)组同时注射联合疫苗，B5、E5组分别注射单价疫苗，于4、8周加强免疫二次。观察各组小鼠血清抗-HBs及抗-HEV特异性抗体情况。 结果表明，预先存在抗-HBs或抗-HEV特异性抗体的小鼠注射联合疫苗后，另一种抗体(抗-HEV或抗-HBs)阳转时间较.B5+E5组推迟2周，直至第8周时抗体全部阳转。全程免疫后各组小鼠抗体阳转率均达到100％，无显著差异，各组小鼠抗体滴度也无明显差异。通过检测各组小鼠抗-HBs、抗-HEV IgG亚类，发现B5+E5(anti-HBs<+>)组小鼠抗-HBs IgG 2a显著高于其他各组，提示预先存在乙肝抗体的小鼠注射联合疫苗以后细胞免疫反应有所增强。 综上所述，我们制备了实验性乙肝一戊肝联合疫苗，初步观察了其免疫原性。当两种抗原以适当的配比制成联合疫苗后，其免疫原性与单价疫苗无显著差异，且不受预先存在的抗-HBs或抗-HEV干扰。预先存在抗-HBs特异性抗体的小鼠注射联合疫苗后抗-HBs IgG2a显著增高，提示联合疫苗诱导的细胞免疫反应有所增强。