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目的:构建放射敏感的融合启动子E6hTERTp,观察在不同放射剂量诱导下放射敏感增强子增强hTERTp(人端粒酶催化亚基启动子)启动下游基因转录活性及对特异性的影响;并进一步构建含E6hTERTp以及融合UL49片段的自杀基因CD/UPRT.UL49的质粒载体,放射干预诱导其在鼻咽癌CNE-2细胞表达,观察放射条件下该自杀基因/前药系统在鼻咽癌细胞中的体内以及体外放射增敏效应,为探索新的鼻咽癌放射基因治疗奠定实验基础。方法和结果:第一部分:放射诱导型增强子E6对hTERTp靶向性增敏效应研究方法:overlap PCR扩增融合启动子E6hTERTp以及CD/UPRT.UL49片段。基因重组技术构建融合启动子E6hTERTp的报告基因载体PGL3—E6hTERTp,以EGR-1p(早期生长反应因子1启动子)以及hTERTp为对照,经脂质体介导重组质粒与pRL-SV40质粒共转染鼻咽癌CNE-2细胞以及正常人成纤维细胞(HDF),不同放射剂量(0,2,6,10gy)诱导下通过双荧光素酶分析系统检测报告基因的表达效率,研究不同放射剂量对各启动子启动下游基因转录活性及对其特异性的影响;构建自杀基因载体pcDNA3.1(-)E6.hTERTp.CD/UPRT.UL49以及pcDNA3.1(-)E6.hTERTp.CD/UPRT,脂质体介导转染鼻咽癌CNE-2细胞,在0gy,2Gy,6gy,10gy等不同放射条件下,半定量RT-PCR法检验其转录活性,免疫印迹法检测CD/UPRT.UL49以及CD/UPRT蛋白表达:结果:双荧光素酶分析系统检测显示,正常HDF细胞系中,转染PGL3-E6.hTERTp组以及PGL3-hTERTp组无论照射与否,其启动活性均维持在极低水平;在给予0Gy,2Gy,6Gy,以及10Gy放射干预之后,转染CNE-2细胞的各启动子活性均随放射剂量的增加而增加,其中,转染E6.hTERTp各放射剂量组启动活性分别为18.8184±4.1969,102.6512±20.5879,291.7274±35.4752.407.5505±27.1526,放射组比较未放射组分别增加了5.4倍,15.2倍和21.7倍,各放射组两两间同样有显著性差异(p＜0.05)。E6.hTERTp2Gy组、6Gy组以及10Gy组启动活性分别是hTERTp相同放射剂量组的2.4倍,3.5倍和2.8倍,两个启动子组间差异具有统计学意义(p＜0.05),证实鼻咽癌CNE-2细胞中,放射诱导型增强子E6能够明显提高hTERTp放射敏感性,且不影响其肿瘤特异性。自杀基因载体pcDNA3.1(-)E6.hTERTp.CD/UPRT.UL49以及pcDNA3.1(-)E6.hTERTp.CD/UPRT转染CNE-2细胞后,WESTERNBLOTTING显示检测到的特异性蛋白条带。RT-PCR检测显示所有经照射后的实验组mRNA量均要显著高于未照射组(p＜0.05),其中CD/UPRT在6Gy时出现最高值,而CD/UPRT.UL49在6Gy和10Gy处理下,mRNA量没有显著差别(p＞0.05),但均高于0Gy,2Gy时mRNA转录量(p＜0.05);证实放射干预可激发融合启动子E6hTERTp启动下游自杀基因表达。第二部分启动子E6hTERTp介导的自杀基因CD/UPRT.UL49以及CD/UPRT表达对鼻咽癌放射—基因治疗增敏效应的体外实验方法:自杀基因载体pcDNA3.1(-)E6.hTERTp.CD/UPRT.UL49以及pcDNA3.1(-)E6.hTERTp.CD/UPRT经脂质体介导转染鼻咽癌CNE-2细胞,在0gy,2Gy,6gy,10gy等不同放射条件下,高效液相色谱法检测其促进前药系统5-Fc(5-氟胞嘧啶)转化为5-FU(5-氟尿嘧啶)的效率,MTT(四甲基偶氮唑蓝)法检测不同放射剂量下,不同浓度5-Fc对转染自杀基因载体的的CNE-2细胞的杀伤效应并进行两种不同基因治疗组之间以及各基因治疗组与单纯放射治疗组之间细胞存活率对比,用SPSS统计分析软件进行分析。结果:给予前药5-Fc以及放射干预后,高效液相色谱法检测发现,经过照射后转染自杀基因载体pcDNA3.1(-)E6.hTERTp.CD/UPRT以及pcDNA3.1(-)E6.hTERTp.CD/UPRT.UL49载体的孔中均检测到5-Fu,未照射孔没有检测到5-Fu;MTT检测,单纯前药干预浓度为200ug/ml时,细胞生存率为93.04;转染自杀基因载体后,前药浓度为200(ug/ml),给予2Gy,6Gy,10Gy放射干预,CNE-2细胞存活率较野生CNE-2细胞组均明显下降(p＜0.05);放射剂量为2Gy以及10Gy时转染pcDNA3.1(-)E6.hTERTp.CD/UPRT.UL49组比较转染pcDNA3.1(-)E6.hTERTp.CD/UPRT组放射增敏效果更明显(p＜0.05)。第三部分前体药物/自杀基因系统对鼻咽癌放射增敏的原位基因治疗实验研究方法:CNE-2细胞接种裸鼠皮下建立鼻咽癌动物模型,进行脂质体包裹质粒DNA瘤内注射的原位基因(in situ)治疗实验,待肿瘤长宽径达到0.7-1.0cm时,将裸鼠随机分组,瘤内注射脂质体包裹的DNA质粒,以及腹腔注射5-FC,并给予肿瘤局部每天3Gy照射,总剂量9Gy。记录肿瘤体积,比较不同处理组的抑瘤效应;病理切片证实肿块性质。抽提肿瘤组织RNA,RT-PCR反应,鉴定CD/UPRT.UL49基因在肿瘤组织内是否有表达。结果:1×10~7CNE-2细胞接种裸鼠后,9天内均顺利成瘤。未经放射的自杀基因pcDNA3.1(-)E6.hTERTp.CD/UPRT.UL49/前药治疗组没有明显抑瘤效果;放射-自杀基因pcDNA3.1(-)E6.hTERTp.CD/UPRT.UL49/前药治疗组生长抑制率93.7579,优于其他各放射组(p＜0.05),而放射-自杀基因pcDNA3.1(-)E6.hTERTp.CD/UPRT/前药治疗组生长抑制率88.86427,较其放射治疗对照组没有差别(p＞0.05)。病理切片检查各放射组均出现严重坏死。结论:E6.hTERTp.CD/UPRT.UL49自杀基因载体具有放射诱导和肿瘤特异性双重特性,融合了VP22基因片段可以明显增强放射干预下CD/UPRT/5-FC前药系统对鼻咽癌CNE-2细胞的杀伤效应,为鼻咽癌的基因-放射治疗开辟了新思路。