炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是指病因尚不清楚的非特异性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(CrohnS disease，CD)，属于自身免疫病。西方国家发病率一直很高，近年来国内报告日渐增多，累计超过12万例次，已成为消化系统常见疾病和慢性腹泻的主要病因。且多数患者反复发作，迁延不愈，甚至需要手术治疗，不仅给患者带来巨大痛苦，且有癌变风险，因此研究IBD的发病机制并进而指导治疗至关重要。但IBD的病因和发病机制尚未完全明确，已知肠道粘膜免疫系统异常反应所导致的炎症反应在IBD发病中起重要作用。目前大多数研究者认为，该病的发病多与环境、遗传、感染和免疫学因素有关，是一种多基因参与的作用于免疫系统和靶器官的疾病，而免疫学因素在其发病过程中起至关重要的作用。而在参与免疫炎症过程的众多因子和介质里寻找到一个关键因子将是我们研究的重点。　　 动物模型是研究炎症性肠病发病机制的必要工具，目前可通过二种方法建立IBD模型。一种是通过基因敲除和转基因方法建立模型，另一种是通过人工诱导建立模型。前者虽具有自发性的特点，但是技术要求高，对于实验条件限制较大，费用也要求较高。后者方法成熟，易于操作。本实验采用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)灌肠免疫诱导BALB/C小鼠建立炎症性肠病动物模型，该法诱导的小鼠肠炎组织学改变的特点与人类IBD相似，模型持续时间长，能体现急性炎症向慢性转化的动态过程，简单易行，易于复制。　　 CD4+辅助T细胞在IBD发病中的作用已经得到公认，传统的CD4+辅助性T细胞主要分为两个亚群：Th1细胞亚群和Th2细胞亚群。Th17细胞亚群是近几年才得到肯定的一类CD4+T细胞亚群，因其主要分泌IL-17而得名。既往关于IBD病因的研究中，多数学者认为其是由于Th1/Th2的失衡造成IBD发病，但是尚有许多问题无法解释。现已证明，在多种自身免疫性疾病患者及这些疾病的动物模型中IL-17表达均明显升高，且其功能状态与多种自身免疫性疾病的发生密切相关，因此Th17细胞很可能在自身免疫反应的发生和发展中起关键性作用。由此，我们推断Th17细胞很可能与IBD发病密切相关，对其进行深入研究可能为我们寻找出IBD诊断的重要标志物和治疗靶点。若Th17细胞在IBD发病中发挥关键作用，从而可以为治疗IBD提供新的途径。本项工作对于IBD的基础研究和临床诊疗都有重要意义。　　 在IBD的发生过程中，细胞因子网络的变化对疾病的发生和发展起到重要的作用。一些促炎细胞因子在IBD患者中存在分泌水平的变化，提示这些促炎细胞因子参与了IBD的病理过程。本实验通过观察BALB/C小鼠IBD模型中的促炎细胞因子的变化和IL-17对其产生水平的影响，进一步探讨Th17细胞在IBD发病中的作用机制。　　 IBD患者存在免疫细胞凋亡异常，免疫细胞不正常凋亡可能是导致IBD发生的始动原因。因此本实验通过观察免疫后BALB/C小鼠脾单核细胞凋亡的变化和IL-17对其凋亡水平变化的影响，进一步研究Th17细胞在炎症性肠病发病中的作用机制。　　 材料和方法：　　 1、模型建立　　 BALB/C小鼠，称重编号后，随机分为正常对照组和IBD模型组，正常对照组正常喂养。模型组参考文献用TNBS溶液灌肠建立小鼠IBD模型，制造模型前给予禁食24h，予5％水合氯醛0.08ml腹腔注射麻醉，按1:1混合TNBS和50%乙醇溶液共0.2ml给予小鼠灌肠，灌肠后正常喂养。处死小鼠后取病变较重部位结肠组织，还分别取外周血，脾脏及肠系膜淋巴结。　　 2、外周血单核细胞的制备小鼠经眼球取血，将血置于抗凝管中，经Ficoll-Hypaque分离液密度梯度离心，得到外周血单核细胞(PBMC)。　　 3、脾单核细胞的制备小鼠脾脏细胞悬液，经Ficoll-Hypaque分离液密度梯度离心，得到脾单核细胞(SMC)。　　 4、脾单核细胞的培养把灌肠后3天处死小鼠所需培养的SMC分为3组，每组含SMC1×106/ml，将三组细胞置于RPMI-1640培养液中并分别加入1 u g/ml抗IL-17抗体，10ug/ml抗IL-17抗体，等量PBS。正常对照组小鼠取1×106/mlSMC亦置于RPMI-1640培养液中并加入等量PBS，四组细胞均置于37℃5％CO2孵箱中培养24h后取出。　　 5、ELISA法检测结肠组织IL-17和IFN-γ　　 组织匀浆离心取上清液，严格按照试剂盒说明操作，终止反应后在450nm处读取各孔吸光度值以各孔OD值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标绘制标准曲线，根据样品OD值查找对应的浓度。　　 6、Western blot法检测IL-17蛋白水平的变化用Western blot法检测正常对照组和模型组3天处死小鼠血单核细胞，脾单核细胞，肠系膜淋巴结细胞及结肠组织IL-17蛋白水平的变化。先将各组细胞及组织提取总蛋白，紫外分光光度计法进行蛋白定量后进行SDS-PAGE，电泳后转至PVDF膜，室温封闭2小时，加入一抗1:800兔抗鼠IL-17抗体，4℃孵育过夜，PBS洗膜，加入二抗1:1000羊抗兔IgG/HRP，室温孵育2小时，沈膜3次，化学发光试剂反应5分钟，曝光、显影。　　 7、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定各组脾单核细胞IFN-γ，TNF-a，IL-6mRNA表达按照试剂盒说明书操作提取细胞总RNA，用紫外分光光度计测定样品，以确定RNA的质量并计算浓度。将RNA进行逆转录反应合成cDNA用于PCR扩增。b-actin为内参照，上游引物为GAATACTCTATTGCCGATGGT，下游引物为CGATGGGTTTGCGTTTG，扩增长度为722bp。TNF-a上游引物为TTACGCCTTTGAAGTTAGCAG，下游引物为CGTCCAAATACATCGCAAC，扩增长度为498bp。IL-6上游为ACAACGGGTGGAACATTACC，下游引物为TGGGTTTGCGTTTGTGAG，扩增长度为422bp。IFN-γ上游引物为ACCCTCCTGGTTATTGAGCC，下游引物为TGGTAATGTTCCACCCGTTG，扩增长度为288bp。扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，经紫外凝胶成像分析系统分析，根据目的基因条带吸光度和内参特异性条带的吸光度比值作为目的基因的相对表达量。　　 8、用流式细胞仪检测脾单核细胞培养液中加入抗IL-17抗体后，脾单核细胞凋亡的变化把脾单核细胞离心后5分钟，用200ul Binding Buffer重悬细胞后再离心5分钟，加入10ul AnneexinV-FITC和5ulPI，再加入300ulBinding Buffer，1h内流式细胞仪上机检测。　　 结果：　　 1、用TNBS灌肠可以成功诱导BALB/C小鼠结肠炎模型2、ELISA实验结果小鼠灌肠后ELISA法检测IL-17和IFN-γ在结肠组织中的表达。其中IL-17在灌肠后1天就明显增高，灌肠后3天达到高峰后开始下降，灌肠后14天和21天组与对照组比较无明显差异。IFN-γ在灌肠后1天无明显增高，后缓慢升高，至灌肠后3天才有显著增高，灌肠后7天达到高峰后开始下降，灌肠后14，21天与对照组比较仍有显著差异。以上结果提示在TNBS诱导的结肠炎中IL-17的作用早于IFN-γ的作用。IL-17在灌肠后3天时表达最高，因此把灌肠后3天小鼠作为进一步研究对象。　　 3、Western blot检测不同组织IL-17蛋白水平Western blot检测正常对照组和模型3天组小鼠血单核细胞，脾单核细胞，肠系膜淋巴结细胞及结肠组织IL-17蛋白水平的变化，其中模型组脾单核细胞，肠系膜淋巴结细胞，结肠组织IL-17均较正常对照组明显增高，尤其以结肠组织升高明显。模型组血单核细胞IL-17与对照组相比无明显差异。　　 4、RT-PCR检测 TNF-a、IFN-γ、IL-6mRNA表达模型组3天小鼠脾单核细胞分别加入PBS、1 ug/ml抗IL-17抗体、10 ug/ml抗IL-17抗体和正常对照组脾单核细胞加入PBS，四组细胞培养24h后用RT-PCR法检测TNF-a、IFN-γ、IL-6mRNA的表达。其中模型组中的PBS组TNF-a、IFN-γ、IL-6与正常对照的PBS组比较差异显著。模型组中的1 ug组TNF-a、IL-6与模型组中的PBS组比较有所下降但无差异，而模型组中的1ug组IFN-γ与模型组中的PBS组比较亦无显著性差异。模型组中的10ug组TNF-a、IL-6与模型组中的PBS组比较差异显著，而模型组中的10ug组IFN-γ与模型组中的PBS组比较无显著性差异。　　 5、流式细胞仪检测脾单核细胞凋亡模型组脾单核细胞分别加入PBS、1 ug/ml抗IL-17抗体、10 ug/ml抗IL-17抗体和正常对照组脾单核细胞加入PBS，四组细胞培养24h后用流式细胞仪检测细胞的凋亡。模型组中和PBS共同培养的脾单核细胞与正常对照组和PBS共同培养的脾单核细胞相比，凋亡比例明显减少(p<0.05)，模型组中和1ug/ml抗IL-17抗体共同培养的脾单核细胞与模型组中和PBS共同培养的脾单核细胞相比，凋亡比例有所增加但不明显。模型组中和10ug/ml抗IL-17抗体共同培养的脾单核细胞与模型组中和PBS共同培养的脾单核细胞相比，凋亡比例明显增多结论：　　 1、用TNBS灌肠可以成功诱导BALB/C小鼠结肠炎模型2、Th17细胞具有组织器官的特异性及靶向性3、Th17细胞在IBD发病的早期阶段起关键性作用，Th1细胞在维持炎症的持续中发挥作用4、在IBD发病过程中Th17细胞和Th1细胞起到协同作用5、Th17细胞可通过促进下游细胞因子产生促进IBD的发生和发展6、Th17细胞可以通过抑制单核细胞凋亡促进IBD的发生。