可可毛色二孢菌效应子LtCre1在葡萄中的互作靶标筛选

来源 :大连理工大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:haolong12345
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葡萄(Vitis vinifera L.)是一种营养价值极高的经济型水果,深受人们的喜爱。但葡萄易受病原真菌的侵染而发生病害,严重影响葡萄的品质和产量。由葡萄座腔菌科真菌引发的葡萄溃疡病(Botryosphaeria dieback)是危害葡萄产业发展的重要病害,其中可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)是造成该病害的主要病原真菌之一。效应子(effector)是病原菌与植物互作过程中分泌的可以改变寄主细胞结构和功能的蛋白分子,使病原菌容易定殖在寄主植物中发挥作用,但目前对L.theobromae效应子的蛋白功能研究报道较少。旨在揭示L.theobromae对寄主葡萄的致病性,为植物病害的防治和抗病品种的选育提供思路,本文主要探究由L.theobromae释放的有重要调控作用的效应子LtCre1对葡萄的作用机理和L.theobromae特有效应子LT397受逆境胁迫下的基因转录水平。主要研究结果如下:(1)利用酵母双杂交技术预筛选L.theobromae效应子LtCre1与葡萄cDNA文库互作的候选蛋白,共有210余个候选蛋白既与效应子LtCre1全长互作又与效应子LtCre1-N端互作。对候选的互作蛋白酵母质粒DNA的提取、转化和对单克隆菌液进行测序。利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)和The Grape Genomes数据库(http://www.genoscope.cns.fr/blat-server/cgi-bin/vitis/webBlat)对候选基因的名称以及功能注释。选取80个候选基因经酵母自激活验证和回转验证发现共有10个候选蛋白既和效应子LtCre1互作又与效应子LtCre1-N端互作。(2)将候选基因进行全长片段克隆并构建到pGAD-T7载体上,利用酵母双杂交一对一验证共有3个候选蛋白既与效应子LtCre1全长互作又与效应子LtCre1-N端互作。将三个候选蛋白命名为VvCIP2、VvCIP4和VvCIP5。(3)利用双分子荧光互补技术(Bimolecular fluorescence complementary technology)在植物表达系统中验证两个具有功能特征的候选蛋白VvCIP2、VvCIP4与效应子LtCre1互作。(4)构建效应子LtCre1和候选蛋白的原核表达载体,利用大肠杆菌进行重组蛋白的小量表达证实3个目的蛋白均以可溶性蛋白的形式存在,为下一步利用GST-pull down技术验证候选蛋白与效应子LtCre1体外互作机制奠定基础。(5)对可可毛色二孢菌特有效应子LT397烟草瞬时表达发现:效应子LT397可抑制由水稻细菌性谷枯病菌Burkholderia glumae引发的过敏反应(hypersensitive response,HR),即该效应子会抑制植物的防御反应;利用q-PCR技术对效应基因LT397受逆境胁迫下转录表达分析发现:LT397在营养缺少、氧化、离子、酸碱和UV胁迫下基因的相对转录水平都上升。
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