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研究目的:本课题从PD-1/PD-L1和CD28/CD80信号通路为切入点,观察软肝饮对HBV转基因小鼠i NKT细胞功能的影响,揭示软肝饮治疗HBV转基因小鼠的免疫调节机制。研究方法:将50只雌雄各半的SPF级BALB/C品系HBV转基因小鼠随机分为中药治疗组(软肝饮高剂量组、中剂量组、低剂量组)、阳性对照组、模型对照组以及10只雌雄各半同窝非HBV转基因正常小鼠作为空白对照组。中药治疗组予不同剂量中药软肝饮(含软肝饮方生药浓度为2、1、0.5g/ml)灌胃,阳性对照组予恩替卡韦分散片液灌胃,模型对照组及空白对照组予生理盐水灌胃,各组均连续给药4周后取材。用q-PCR技术检测外周血及肝组织中HBV DNA表达,HE染色观察肝组织病理。ELISA检测血清中ALT、AST、TBIL、LN、HA、IV-C、PCIII、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ含量,流式细胞仪检测外周血i NKT细胞及其表面PD-1、PD-L1、CD28、CD80表达,免疫荧光法检测肝脏i NKT细胞及其表面PD-1、PD-L1、CD28、CD80表达。研究结果:1、在用q-PCR技术检测小鼠外周血及肝组织中HBV DNA表达结果中:与模型组比较,软肝饮高剂量、中剂量组及阳性对照组HBV转基因小鼠血清和肝组织中HBV DNA含量明显降低,有统计学差异性(P<0.01/P<0.05);而软肝饮低剂量组HBV转基因小鼠血清及肝组织中HBV DNA含量虽有下降趋势,但无明显差异性(P>0.05)。2、在肝脏病理HE染色结果中:模型组小鼠肝细胞排列欠规整,细胞肿胀变形严重,甚至死亡,肝索形态消失,炎性细胞浸润;而软肝饮高剂量、中剂量组及阳性对照组均有不同程度的改善病变,中药软肝饮低剂量效果不显著。3、在ELISA检测血清中ALT、AST、TBIL、LN、HA、IV-C、PCIII、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ含量结果中:(1)与空白对照组相比,模型组ALT、AST、TBIL水平明显比空白对照组高,有显著差异性(P<0.01);与模型组相比,治疗后软肝饮高剂量组和阳性对照组ALT、AST、TBIL水平均明显低于模型组,有统计学意义(P<0.01/P<0.05);而治疗后软肝饮中剂量、低剂量组ALT、AST、TBIL水平与模型组无统计学意义(P>0.05)。(2)与空白对照组相比,模型组LN、HA、IV-C、PCIII水平明显比空白对照组高,有显著差异性(P<0.01);与模型组相比,治疗后软肝饮高剂量组和阳性对照组LN、HA、IV-C水平明显低于模型组,有显著差异性(P<0.01);治疗后软肝饮高剂量组和阳性对照组PCIII水平低于模型组,有一定差异性(P<0.05);而治疗后软肝饮中剂量、低剂量组LN、HA、IV-C、PCIII水平与模型组无统计学意义(P>0.05)。(3)与空白对照组相比,模型组IL-10、IL-2、IFN-γ水平明显比空白对照组低,有显著差异性(P<0.01);模型组IL-4水平明显比空白对照组高,有显著差异性(P<0.01);与模型组相比,治疗后软肝饮高剂量、中剂量组和阳性对照组IL-10水平明显高于模型组,有显著差异性(P<0.01);软肝饮低剂量组IL-10水平与模型组无明显差异性(P>0.05);治疗后软肝饮高剂量、中剂量组和阳性对照组IL-2、IFN-γ水平高于模型组,有一定差异性(P<0.05);软肝饮低剂量组IL-2、IFN-γ水平与模型组无明显差异性(P>0.05);治疗后软肝饮高剂量、中剂量组和阳性对照组IL-4水平明显低于模型组,有显著差异性(P<0.01);软肝饮低剂量组IL-4水平与模型组无明显差异性(P>0.05);4、在流式细胞仪检测外周血i NKT细胞及其表面PD-1、PD-L1、CD28、CD80表达结果中:(1)与空白对照组相比,模型组i NKT细胞表达明显降低,有显著差异性(P<0.01);与模型组相比,治疗后软肝饮高剂量组和阳性对照组i NKT细胞表达明显增高,有显著差异性(P<0.01);软肝饮中剂量组i NKT细胞表达有一定增加,有一定差异性(P<0.05);软肝饮低剂量组i NKT细胞表达无明显变化,无明显差异性(P>0.05);(2)与空白对照组相比,模型组i NKT细胞表面PD-1、PD-L1的表达水平明显增高,有显著差异性(P<0.01);与模型组相比,治疗后软肝饮高剂量组和阳性对照组i NKT细胞表面PD-1、PD-L1的表达水平降低,有一定差异性(P<0.05);软肝饮中剂量、低剂量组i NKT细胞表面PD-1、PD-L1的表达水平无明显变化,无明显差异性(P>0.05);(3)与空白对照组相比,模型组i NKT细胞表面CD28、CD80的表达水平有一定的下调趋势,有统计学意义(P<0.01/P<0.05);与模型组相比,治疗后软肝饮高剂量、中剂量组和阳性对照组i NKT细胞表面CD28、CD80的表达水平明显升高,有显著差异性(P<0.01);软肝饮低剂量组i NKT细胞表面CD28、CD80的表达水平无明显变化,无明显差异性(P>0.05)。5、在免疫荧光法检测肝脏i NKT细胞及其表面PD-1、PD-L1、CD28、CD80表达结果中:HBV转基因小鼠肝脏中细胞i NKT表面的表达明显低于空白对照组,i NKT细胞表面PD-1、PD-L1的表达明显高于空白对照组,而i NKT细胞表面CD28、CD80的表达则明显低于空白对照组,均有统计学意义(P<0.05)。通过软肝饮高、中、低剂量组及阳性对照组治疗4周后,与模型组相比,软肝饮高、中剂量组及阳性对照组HBV转基因小鼠肝脏细胞i NKT细胞的表达均明显增加,i NKT细胞表面PD-1、PD-L1的表达均明显降低,而i NKT细胞表面CD28、CD80的表达则明显升高,有一定差异性(P<0.05);软肝饮低剂量组HBV转基因小鼠肝脏细胞i NKT细胞及其表面PD-1、PD-L1、CD28、CD80的表达与模型组相比无明显变化,无统计学意义(P>0.05)。结论:1、中药软肝饮能够改善HBV转基因小鼠肝组织损伤,具有一定的保护肝功能、抗肝纤维化作用。2、中药软肝饮对HBV转基因小鼠有一定的抑制HBV的作用,其作用机制可能与调控IL-10、IL-2、IL-4、IFN-γ水平有关。3、中药软肝饮治疗HBV转基因小鼠的免疫机制可能通过阻断i NKT细胞上PD-1/PD-L1信号通路以及激活i NKT细胞上CD28/CD80信号通路,调控i NKT细胞功能发挥抗HBV作用。