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从小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）的建立开始,关于胚胎干细胞的不同状态一直都是关注的热点,继原始态（na（?）ve）和激发态（primed）之后,最近Austin Smith研究组又建立了一种位于na（?）ve和primed之间的形成态（formative）的干细胞系,即FS cells。结合实验室先前的发表结果,我们选择从na（?）ve和primed状态的培养条件中各选取一个细胞因子,尝试建立na（?）ve和primed中间状态的细胞,并最终确定了激活素A（Activin A）和白血病抑制因子（LIF）的组合（AL）支持新型干细胞的建立。具体实验结果如下:1.首先,利用AL培养体系建立来源于小鼠着床后原肠胚（E6.5）的新型胚胎干细胞系,并命名为ALSCs。以小鼠上胚层胚胎干细胞（Epi SCs）的建系过程作为对照,发现ALSCs的建系过程和克隆形态,均与Epi SCs类似。ALSCs的建系效率为26.9%,低于Epi SCs的建系效率58%。碱性磷酸酶染色实验显示ALSCs呈紫红色的阳性结果,初步确定ALSCs具有多能性,核型分析证明其具有正常的染色体数目。生长曲线测定和单细胞建系实验结果,显示ALSCs与Epi SCs具有相似的增殖速度,以及相近的单细胞建系效率。RT-q PCR结果证明,ALSCs中多能基因、PGC标志基因、DNA甲基化相关基因和Epi SCs标志基因的转录水平均位于Epi SCs和ESCs之间。免疫荧光染色结果证明,ALSCs在蛋白水平表达多能基因,同时雌性ALSCs具有一条失活的X染色体。此外,在AL培养体系下,同样获得了来源于囊胚的小鼠新型胚胎干细胞系,命名为b ALSCs。b ALSCs具有与ALSCs相似的形态和碱性磷酸酶染色结果,且GOF/GFP阳性囊胚来源的b ALSCs不表达GOF/GFP绿色荧光蛋白。b ALSCs的建系效率为35.7%。多能性基因、三胚层基因等的表达与ALSCs的结果相似,但DNA甲基化相关基因在b ALSCs中的转录水平同时高于Epi SCs和ESCs。2.其次,对ALSCs体内多能性进行分析。通过畸胎瘤实验,证实ALSCs具有体内分化为三胚层的潜力。然而体内嵌合体实验发现ALSCs与Epi SCs相同,收取的E6.5胚胎中没有观察到红色荧光td Tomato+ALSCs。进一步,我们将td Tomato+ALSCs注入八细胞胚胎,体外培养两天后,观察到囊胚嵌合体中的td Tomato+ALSCs明显减少,说明ALSCs不具备体内贡献至嵌合体的能力。另外,体外分化实验也证明ALSCs的体外发育潜力与Epi SCs相似。单因子培养实验结果显示激活素A对于维持ALSCs的自我更新和多能性更重要,在激活素A单独培养的条件下,ALSCs可以维持基本的形态和自我更新。3.随后,对ALSCs的转录组进行分析。先将ALSCs与Epi SCs对比得到的差异基因,进行GO富集分析,结果显示差异基因主要富集在,细胞分化和组织发育的生物学过程上。KEGG结果表明,差异基因多富集在Wnt信号通路和调节多能性等通路上。将ALSCs与Austin Smith发表的FS cells对比,得到的差异基因,经过GO富集分析表明,差异基因同样主要富集在细胞分化和机体发育方面。取ALSCs vs Epi SCs和ALSCs vs FS cells差异基因的交集,进行GO分析,发现差异基因主要富集在机体发育等生物学过程方面,以及细胞组分中的细胞器上。KEGG分析显示差异基因显著富集在Hippo通路,Wnt通路和调控多能性的通路。4.最后,将ALSCs向na（?）ve ESCs方向诱导,发现ALSCs与Epi SCs不同,可以直接成功地诱导为na（?）ve状态的重编程胚胎样干细胞（r ESCs）,且低密度ALSCs或者单细胞ALSC也可以诱导至r ESCs。同时,在诱导过程中,观察X染色体激活和GOF/GFP的激活过程,发现X染色体的活化先于GOF/GFP的激活。进一步,Epi SCs在AL培养条件下培养10代以上（命名为epi ALSCs）,也可以诱导至na（?）ve状态的r ESCs,即两步法诱导体系（AF-AL;AL-CL）。将骨形态形成蛋白4（BMP4）或Activin A的抑制剂添加至ALSCs向r ESCs的诱导体系,发现并不影响r ESCs的产生;但将BMP4抑制剂添加至Epi SCs两步法诱导体系中,会导致其不能成功诱导为r ESCs。综上所述,利用激活素A和白血病抑制因子LIF,我们建立了一种新型的胚胎干细胞系,该细胞系可以维持自我更新以及多能性基因的表达,且可以成功诱导为na（?）ve状态的r ESCs,包括primed状态的Epi SCs也可以通过两步法成功诱导为r ESCs。本论文为研究不同状态的小鼠胚胎干细胞,以及不同细胞因子对小鼠胚胎干细胞的影响,提供了更多的研究材料和理论基础。