乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤,严重威胁着女性的健康。早期诊断、早期治疗、复发和转移监测对于降低乳腺癌死亡率非常重要。乳腺钼靶摄片、肿块活体组织检查等常规乳腺癌诊断方法存在放射性损伤、侵入式活检取样给病人造成痛苦,同时难以达到乳腺癌早期诊断的目的等缺点。液体活检可通过无（微）创方式采集血液、尿液等多样化体液中的多重分子标志物,实现对肿瘤发展进程和治疗响应的连续、动态、精准的监测,有助于癌症的早期诊断、准确预后、个性化治疗及复发转移监测。外泌体是由细胞分泌且具有血液中分布浓度高、内含物如核酸、蛋白等成分可反映亲本细胞的状态和变化等优点,最重要的是循环外泌体中的microRNA（miRNA）是一类对疾病预测及诊断的新型液体活检生物标志物。因此建立针对外周血中外泌体内相关表达的miRNA的液体活检的方法对乳腺癌的诊断更具有重要意义。本论文选择4种在乳腺癌患者血浆外泌体中异常表达的miRNA作为诊断乳腺癌的生物标志物,设计制备了 3种可直接进入血浆外泌体内原位检测这些miRNA表达量的纳米金荧光探针,并建立了基于这些探针的诊断乳腺癌的液体活检方法。该方法取样无创、简便快捷、灵敏准确、经济价廉,具有较强的临床转化前景,有望为乳腺癌的早期筛查、疗效评价、复发和转移监测提供新的途径。全文实验结果简述如下:一.通过氯金酸还原法制备了 13nm的纳米金溶胶,以此为原料用冷冻法合成了检测miR-1246的键合高密度寡核苷酸链的球形纳米金荧光探针,并用可见光谱、纳米颗粒追踪技术、透射电子显微镜成像等技术对其形貌、粒径等进行了结构表征。探针可定量检测合成的miR-1246,检测限0.68 nM,线性范围0～30 nM,最大检测浓度为50nM,并对miR-1246有特异性响应。通过透射电镜和超高分辨光学显微镜影像、阴性探针对照实验、实时荧光定量PCR对照实验等一系列手段证实,miR-1246探针与MCF-7细胞上清液外泌体仅需简单共孵4 h,即可进入其中实现对miR-1246表达水平的原位、灵敏、特异性的响应,产生定量荧光信号。通过加样回收率实验和透射电镜实验证明该探针可与血浆直接孵化进入血浆外泌体产生定量荧光信号。基于miR-1246探针建立了诊断乳腺癌的液体活检方法,无需分离富集血浆标本中的外泌体,探针仅需与40 μL血浆简单孵化4h,即可产生显著区分乳腺癌与正常血浆的荧光信号。通过对46例乳腺癌患者与28例健康对照组的血浆标本进行检验,结果表明受试者特征工作曲线图在最佳截段点处诊断的敏感度为100%,特异性为92.9%,曲线下面积0.9821,具有很高的准确度。二.为更精准地诊断乳腺癌,设计合成了可以同时检测miR-1246和miR-21及可同时检测miR-1246、miR-105和miR-122的2种纳米金荧光探针,并对它们的检测性能和对乳腺癌的诊断应用做了初步研究。两种探针对合成的目标miRNA可以实现同时检测,最低检测限约0.18nM,但线性范围较小,最大检测浓度较低。在简单孵化条件下,两种探针均能产生外泌体浓度依赖的荧光信号,且灵敏度较高。两种探针对少量的已试验的血浆标本的液体活检可以准确区分乳腺癌和正常对照组。尚需进一步实验优化探针结构,获得更大的外泌体检测浓度范围,进一步的特异性响应实验验证,以及更多的临床血浆样本验证探针诊断乳腺癌方法的准确性。本课题首次实现了纳米金荧光探针对血浆外泌体中miRNA的原位检测,建立了基于探针的敏感度高、特异性强、简单廉价、稳定可靠的具有临床应用价值的无创液体活检方法,为乳腺癌的早期筛查、疗效评价、复发和转移监测等提供了新的途径。