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宰后猪肉中内源性蛋白酶的酶解作用对肉品质的变化有重要影响,尤其是肌原纤维中关键蛋白的降解能够改善肌肉的嫩度和保水性。然而对于酶解作用与宰后猪肉保水性的关系仍缺乏深入的研究,其背后的机制尚不明确。在宰后肌肉中能够发挥酶解作用的主要三种内源性蛋白酶包括钙调蛋白酶、蛋白酶体和组织蛋白酶。本文采用实时荧光定量PCR的方法考察猪背最长肌中钙调蛋白酶2、20S蛋白酶体亚基β1、β2、β5、组织蛋白酶B和L的基因转录水平,考察宰后冷藏条件下猪背最长肌中钙调蛋白酶2、20S蛋白酶体、组织蛋白酶B+L的活性变化和肌间线蛋白、α-辅肌动蛋白的含量变化,同时考察宰后有关猪肉保水性的变化,分析这三类酶基因转录水平、宰后活性变化与猪肉保水性的相关性。此外,本文还研究了均质、离子交换层析、盐析、凝胶过滤层析和浓缩等方法对这三种酶的分离纯化效果及三种酶的性质,建立酶与肌原纤维的孵育模型,考察了蛋白酶解对肌原纤维保水性和肌原纤维内部空间结构的影响,以探明内源性蛋白酶在宰后猪肉成熟过程中的作用及机制,为提高宰后肌肉保水性、充分利用肉类资源提供理论依据。主要研究结果如下:1.三类内源性蛋白酶在猪肉中基因转录水平高低顺序依次为20S蛋白酶体亚基β2>组织蛋白酶B>组织蛋白酶L>钙调蛋白酶2>20S蛋白酶体亚基β1>20S蛋白酶体亚基β5。20S蛋白酶体亚基β1的基因转录水平与嫩化的速率和肌原纤维水分约束力增长速率相关系数为0.563、-0.597(P<0.05),20S蛋白酶体亚基β5的基因转录水平与嫩化的速率和肌原纤维水分约束力增长速率相关系数为0.513、-0.037(P<0.05),钙调蛋白酶2的基因转录水平与肌原纤维水分约束力增长率相关系数为0.746(P<0.05)。2.宰后猪肉中的钙调蛋白酶2活性、20S蛋白酶体活性逐渐降低,而组织蛋白酶B+L活性升高。钙调蛋白酶2活性与肌原纤维中肌间线蛋白含量相关系数为0.997(P<0.01),与剪切力相关系数为0.986(P<0.05),与贮藏损失相关系数为-0.986(P<0.05)。20S蛋白酶体活性与被释放的α-辅肌动蛋白含量相关系数为-0.815(P<0.05),与剪切力相关系数为0.991(P<0.01),与贮藏损失相关系数为-0.975(P<0.01)。组织蛋白酶B+L活性与肌原纤维水分约束力相关系数为0.916(P<0.05)。宰后肌原纤维中肌间线蛋白含量与剪切力相关系数为0.987(P<0.01),被释放的α-辅肌动蛋白与肌原纤维水分约束力相关系数为0.942(P<0.05)。3.分离纯化得到的钙调蛋白酶2分子量约为80kDa,比活为38.87U/mg蛋白,纯化倍数为36.33,得率为24.76%;得到的20S蛋白酶体分子量约为700kDa,比活为109.2U/mg蛋白,纯化倍数为266.34,得率为12.42%。得到的组织蛋白酶B+L,其分子量约为32~35kDa,比活为206.67U/mg蛋白,纯化倍数为120.86,得率为16.97%。钙调蛋白酶2在pH值为7.0和7.5、温度为25℃时活性最高,KCl的加入会降低酶的活性;在20S蛋白酶体的三种活性中,pH值为7.0和7.5时类糜蛋白酶活性和肽基谷氨酰肽水解酶活性最高,pH值为8.0和8.5时类胰蛋白酶活性最高,三种活性的最适温度都在37℃左右,且KCl的加入都会降低这三种活性;pH值为5.5、温度为45℃时,组织蛋白酶B+L的活性最高,当KCl浓度低于300mM时会升高酶的活性。4.在孵育体系中随着这三类酶含量的增加,肌原纤维的保水性升高,同时肌原纤维蛋白发生降解,肌间线蛋白被钙调蛋白酶2和组织蛋白酶B+L降解,α-辅肌动蛋白被20S蛋白酶体释放。此外,20S蛋白酶体比钙调蛋白酶更易于降解肌原纤维中分子量较小的蛋白,或在钙调蛋白酶发挥酶解作用之后进一步将蛋白降解为分子量更小的蛋白或多肽,而且20S蛋白酶体在pH值7到5.5的下降过程中均能发挥酶解作用和影响肌原纤维的保水性。综上所述,钙调蛋白酶、蛋白酶体和组织蛋白酶对宰后猪肉的成熟有着重要的影响作用。内源性蛋白酶通过发挥酶解作用降解或释放肌肉中的蛋白改变了肌肉中的结构来影响猪肉的品质,从而促进了猪肉的成熟。