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熊胆粉作为药品和保健食品已经被使用近千年。熊脱氧胆酸(UDCA)，顾名思义是从熊胆汁中分离出来的一种胆酸，它是熊胆的主要药用活性成分，广泛用于脂肪性肝病、药物性肝炎、病毒性肝炎等胆汁淤积性肝病的治疗。为解救黑熊不被捕杀取胆以及减少活熊取胆的不人道行为，人工高效合成熊脱氧胆酸是必不可少的。鹅脱氧胆酸(CDCA)是熊脱氧胆酸的立体异构体，它能大量地从鸡、鸭、鹅等家禽类的胆汁酸中获得，来源广泛。从CDCA酶法催化构型翻转合成UDCA，因其高效性和相对环境友好性，被选为本论文的研究途径，最终目标是快速高效地制备珍贵难得的UDCA。 7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)，是酶法催化CDCA生物转化合成UDCA的关键瓶颈酶，其活性、稳定性以及辅酶亲和力均显著地影响酶促转化路线的技术经济性。本论文从这一关键酶出发，以文献报道的两个酶7β-HSDHCa1和7β-HSDHCa2的蛋白序列为探针，在基因数据库中搜索相关的酶，根据其同源性和进化树进行初筛，最终通过异源表达及功能验证得到一个来源于Ruminococcus torques ATCC35915菌株的7β-HSDHRt，它能高效催化7-羰基-石胆酸(7-oxo-LCA)还原转化为UDCA。研究表明，7β-HSDHRt酶的分子量为29.4kDa，在40℃表现出最高催化活力，还原活力的最适pH为6.5，氧化活力的最适pH为10.0，在30℃、40℃、45℃和50℃时的半衰期分别为27h、10h、16min和2min。在获得酶法合成UDCA的关键酶7β-HSDHRt并对其酶学性能进行表征之后，利用该酶与文献报道的7α-HSDH酶进行偶联催化，将CDCA转化为UDCA。首先尝试的策略是，利用相同的辅酶依赖型，将来自菌株Clostridium absonum的7α-HS DHCa1与7β-HSDHRt偶联，通过辅酶的内部自循环，将CDCA生物转化为UDCA。由于存在化学平衡，底物无法完全转化，产率仅为73％。为提高UDCA的最终产率，采用一锅两步法策略，引入乳酸脱氢酶(LDH)和葡萄糖脱氢酶(GDH)分别用于两步酶反应的辅酶循环，以推动反应不可逆地向目标方向进行;同时，在两步酶反应的间歇添加一步热处理步骤，目的是使第一步反应中的酶完全失活，以避免在第二步反应时7-羰基-石胆酸重新还原为CDCA，从而实现CDCA立体构型的完全翻转，全部转化为目标产物UDCA，最终产率高达98％，使得最终产物的分离纯化更加简单。 迄今为止文献报道的所有7β-HSDHs大多具有活性低、稳定性差以及工作pH与7α-HSDH不相容等共同缺陷，从而导致目标产物UDCA的时空产率十分有限，因此接下来针对上述弱点开展分子改造研究。这里，我们提出了一种多目标共进化策略((m)ulti(o)bjective(d)irected(e)volution，简称MODE)，用于同时改造7β-HSDHRt的催化活性、热稳定性和最适pH值。通过易错PCR、DNA shuffling和定点突变等方法，最终获得一个双突变体V3-1(T189V/V207M)，其活力与母本相比提高5.5倍，半衰期延长3倍。此外，突变体的最适pH向弱碱性方向移动(pH6.5→pH7.5)，从而更接近于前置酶7α-HSDH催化脱氢反应的最佳酸碱度(pH8.0)。使用上述多目标共进化的突变酶V3-1进行级联转化反应时，UDCA的时空产率达到471g L-1d-1，显著高于天然酶的71g L-1d-1。 由于引入辅酶再生过程，使得级联反应所需要的酶增加至4个，若对其一一发酵，将耗时耗力，不利于工业应用。因此，将改造后的7β-HSDHRt与葡萄糖脱氢酶(GDH)进行共表达，同时构建E.coli7α-HSDH和乳酸脱氢酶(LDH)的共表达体系，并对酶的共表达条件如诱导温度、诱导时间和诱导剂用量等进行逐一优化。共表达体系的成功构建，使得酶的发酵工作量减半，显著提高了生产效率。为重复使用酶以降低生产成本，对上述共表达的酶进行了共固定化。首先尝试不同的固定化方法，通过比较固定化后的酶上载量和活力回收率，最终选择带有环氧基功能基团的树脂ES-103作为载体与酶通过共价结合的方式制备固定化酶。通过对固定化pH、固定化时间和固定化时酶与树脂的上载比例等参数的优化，最终所得两组共固定化酶LDH-7αHS DH@ES-103和7βHSDH-GDH@ES-103的活力达到43.2Ug-1和25.8Ug-1，分别是固定化条件优化前催化活力的12倍和516倍。接着利用自制的共固定化酶，在填充床反应器中实现从CDCA到UDCA的连续生物转化，避免了分批反应中需要在反应间歇额外增加热处理所带来的弊端，且UDCA的时空产率可达80gL-1d-1。