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南极磷虾(Euphausia superba)作为21世纪新兴产业发展的载体,肌肉中高氟异常是限制其食用开发利用的关键。由于生物体对氟的吸收和生物利用度存在差异,而现有的研究主要集中在对氟的总量分析上,对氟的形态分析方面,还处于初步探索阶段,对南极磷虾肌肉与氟的结合状态也处于假设推断阶段,人们对南极磷虾肌肉中氟形成机制尚不清楚。本研究基于南极磷虾肌肉中氟存在多种形态的结合,以南极磷虾肌肉为实验原材料,采用响应面法优化胰蛋白酶酶解工艺,从肌肉中分离提取多肽,然后采用SDS-PAGE凝胶电泳、超滤、Sephadex G-25葡聚糖凝胶层析、高效液相色谱等一系列技术对多肽进行分离纯化,并将纯化出来的多肽进行氟含量的分析以及分子量的测定,并采用LC-MS/MS将纯化出来的含氟多肽进行氨基酸分析以及蛋白鉴定,建立了一种分离南极磷虾含氟多肽的新方法,并通过蛋白鉴定结合理化性质分析对其结合形式、结构进行初探,旨在为今后南极磷虾资源开发利用提供理论基础,具体研究内容:1.南极磷虾蛋白的酶解工艺研究以氨基氮含量为指标,采用甲醛电位滴定法测定胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶6种生物酶在其最适酶解条件下对南极磷虾蛋白酶解效果,筛选出酶解南极磷虾蛋白的最佳生物酶。在单因素试验基础上,以酶解液中氨基氮含量为响应值,选择酶解温度、时间、pH为自变量,通过三因素三水平Box-Bohnken响应面分析法对筛选出来的生物酶进行酶解工艺的优化。结果表明:胰蛋白酶为酶解南极磷虾蛋白的理想生物酶;响应面分析法建立二次多项回归方程为:Y=51.07-0.83A+1.72B-2.06C+0.25AC+1.15BC-3.06A~2-2.77B~2-3.69C~2,模型p<0.0001,而失拟项p>0.05,表明模型极显著且比较稳定;通过模型分析得到最佳条件是:酶解温度44.48℃、酶解时间8.52 h、pH 7.88,考虑实际应用可行性,我们在酶解温度45.0℃、酶解时间8.5 h,pH 7.9条件下实验得到的氨基氮含量为50.96±1.07 mg/g,与理论预测值51.57 mg/g基本一致。2.南极磷虾肌肉酶解后含氟多肽的分离纯化采用SDS-PAGE凝胶电泳对酶解多肽组分进行分析,然后采用超滤(UF)、Sephadex G-25葡聚糖凝胶层析、高效液相色谱(HPLC)对多肽进行分离纯化,同时对纯化出来的多肽进行氟含量分析及分子量的测定。实验结果表明,电泳分析南极磷虾蛋白分子量在15 kD以上,主要分子量分布在15 kD~45 kD;胰蛋白酶解的多肽分子量在25 kD以下,主要分子量分布在5 kD以下。经超滤、Sephadex G-25葡聚糖凝胶层析、高效液相色谱分离纯化出三部分多肽(分别命名为AKP-I、AKP-II、AKP-III),其中多肽AKP-III纯度较高,只有一个主峰。将三部分多肽采用离子色谱法进行氟含量的测定,得到三部分多肽氟含量分别为AKP-I495.04±2.12μg/g,AKP-II 1219.52±1.11μg/g,AKP-III 209.44±2.17μg/g,分别占三部分总氟量的26%、63%、11%,采用超高效液相色谱-四级杆静电场轨道阱串联质谱仪对三部分多肽进行分子量的测定,得到AKP-I的分子量在1000 Da以下,AKP-II的分子量在2000 Da左右,AKP-III的分子量可达6000 Da。3.南极磷虾含氟多肽的结构与理化特性研究将纯化出来的三部分多肽(AKP-I、AKP-II、AKP-III)在真空、50℃条件下旋蒸,含氟量最高的多肽AKP-II逐渐由无色透明液体转变为乳白色悬浊液。三部分多肽在相同的条件下,呈现出不同的现象,说明三部分多肽理化性质存在差异,AKP-II受温度、压强影响较大,南极磷虾蛋白中的氟可能以矿物盐形式相结合。用LC-MS/MS鉴定纯度高的含氟多肽AKP-III-F6的氨基酸的序列片段,通过NCBI(Euphausia superba)蛋白质数据库检索,按匹配值得分高于100分可筛选鉴定得到四种蛋白质(Clock,Tropomyosin,ATP synthase subunit 6(mitochondrion),Hsp70A),结合含氟多肽理化特性对四种蛋白进行分析,根据现有的数据,认为南极磷虾蛋白结合氟可能与Clock蛋白的磷酸化有关,通过磷酸化来形成稳定的生物矿物质(FHAP),来维持机体的正常代谢与生命活动。