研究背景烧伤,尤其是大面积烧伤后大量组织坏死、明显的应激、休克、感染和营养缺乏等反应,与后续的各种治疗因素一起改变了机体免疫细胞和免疫分子所处的微环境,引起机体发生一系列的免疫学及病理生理学变化,以至于机体免疫功能紊乱的发生。随着烧伤免疫功能紊乱(post burn immune dysfunction,PID)观点的提出,烧伤免疫功能紊乱被认为是烧伤后引发严重感染、多器官系统功能紊乱甚至死亡的重要原因。虽然不断发展的烧伤治疗技术一定程度上改善了患暂的预后,但严重烧伤患哲死亡率并未见明湿降低,无法得到根本改善的烧伤后免疫功能紊乱被认为是其主要的障碍。目前对于烧伤免疫方面的研究多是对免疫细胞(包括T细胞、B细胞、杀伤细胞和单核巨噬细胞等)、免疫因子(如TNF、IL-1和IL-6等)的作用机制或细胞凋亡、细胞死亡、感染和器官损伤等方面的研究,由于从单一的基因及因子的研究出发时很难解释整个细胞或系统的变化的,因此我们需要从整体基因组层次全面了解烧伤后免疫功能的紊乱。基因芯片技术和生物信息学技术的出现为此提供了可能,它从转录水平和DNA层面来了解烧伤后机体发生的病理生理学变化过程。生物领域的新技术(基因芯片、生物信息学)、新的研究方法(功能基因组学、蛋白组学)在临床中逐步得到应用,更新了医学科学基础。另外,医疗实践以循证医学为主,从基因、蛋白质等大分子水平研究疾病的发病机制,对疾病进行预防、诊断和治疗,目标是向特异性诊断、个性化治疗发展。分子水平生物信息监测设备(基因芯片、质谱仪等)将成为医疗领域的新需求。此外,伴随着生物信息学的飞速发展,出现了大量潜在的生物标记,其中一些可以用于疾病诊断和治疗,这些生物标记物信息在临床上应用潜力是巨大的。如何将生物标记物应用于临床诊断、疾病风险评估与开发新的药物靶点等是研究的重点问题。2008年有关研究者利用生物信息学和基因芯片技术对创伤和烧伤后小鼠免疫细胞基因组分析中发现烧伤后可引起免疫系统和炎症反应等多方面的变化。2010年Lars H. Evers,Dhaval Bhavsar等人又已经提出基因芯片从细胞整体基因组水平出发,能为烧伤后免疫功能紊乱机制的研究提供新的思路及治疗靶点。目前生物信息学技术和基因芯片技术应用于烧伤方面已比较普遍,但研究大多是从实验出发分析某一个细胞因子的基因表达情况,芯片所产生的大量数据并未得到更好的利用,数据分析还处于初级阶段的功能验证分析,因此,目前需要对烧伤基因芯片所产生的大量数据进行更深入的生物信息学方面数据的挖掘和分析,以期为烧伤诊断及治疗寻找相关生物靶标。本课题组在前期通过对GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中一组小鼠烧伤后白细胞基因芯片的数据进行分析发现烧伤后小鼠白细胞表现为免疫系统过程、细胞过程、代谢过程、应对刺激反应等方面的紊乱,同时也证实了烧伤后免疫系统功能变化一直贯穿着烧伤的全程,其中在烧伤后第1天基因表达变化最为显著,因此严重烧伤后的异常病理生理变化、并发症的出现、不良预后的发生,可能取决于伤后早期机体对烧伤刺激信号的反应。为此本实验应用生物信息学方法对小鼠烧伤后免疫细胞基因芯片数据进行进一步分析,筛选出烧伤后小鼠应对刺激反应过程中的差异表达基因,并分析差异基因的生物学特性,后续再通过动物实验对所筛选差异基因进行验证,以期了解烧伤后免疫细胞应对烧伤刺激反应变化过程的分子机制,为临床上烧伤早期诊断及药物治疗靶点的筛选提供新方向。本实验包括两个部分：第一部分小鼠烧伤早期刺激反应相关基因靶标的筛选[研究目的]利用生物信息学方法对小鼠烧伤早期免疫细胞差异基因表达谱进行分析,以期对小鼠烧伤后免疫细胞应对刺激反应过程的机制加以了解,为筛选出烧伤早期应对刺激反应相关治疗靶标。[研究方法]1.基因芯片数据筛选：从NCBI的GEO(Gene Expression Omnibus)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ge o/)进行基因芯片样本筛选,样本需满足以下筛选条件：①烧伤动物模型,TBSA>20%,Ⅲ度烧伤或烫伤；②烧伤或烫伤分组时间少于48小时；③样本及对照数目大于3。最终经过芯片质量评估,归类整理后发现,由Lederer JA等提交的GSE7404(动物模型为小鼠,25%TBSA,Ⅲ度烧伤)数据集满足以上筛选条件。我们从中选取烧伤后第1天组免疫细胞样本数据进行分析,总共有8个样本符合条件,其中4个为烧伤组,4个为对照组。本研究所需GSE7404数据是GPL 1261平台Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Array基因芯片,为全血游离白细胞基因芯片。2.基因芯片数据的处理：由于基因芯片平台的差异、系统误差的存在和后期计算的需要,我们对基因芯片数据进行分析之前,需要先进行预处理(pre-procession)。预处理的过程主要包括：数据过滤,去除异常数据和噪音数据；补缺失值,保证数据的完整性；对数转换,以满足正态分布的分析要求；标准化,纠正系统误差,以发现真正的生物学变异。3.功能富集分析：在本次研究中,我们应用GO-function数据包对基因进行功能注释,以有效的处理GO功能中的冗余,使分析结果更加可靠精确。应用DAVID数据库(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)对基因数据进行KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因与基因组百科全书)是由日本京都大学和东京大学联合开发的数据库,KEGG通路富集分析是目前常被使用的芯片数据基因功能分析方法,它利用的数据是一些已经研究清楚的基因之间的相互作用,即就是生物通路。本研究通过DAV ID数据库所筛选刺激反应相关差异基因,并选取刺激反应相关差异基因进行KEGG通路富集分析后,选取与烧伤后免疫细胞刺激反应相关通路。4.刺激反应相关基因蛋白互作网络构建及分析：将选取的免疫系统相关差异基因应用DAVID进行基因ID转换,将转换的差异基因输入到STRING9.1数据库中,选取交互作用评分大于0.4(中等可信度)的互作关系构建刺激反应相关差异基因的蛋白互作网络(Protein-protein interaction network)。网络分析及MCL子网络聚类分析采用生物图表可视化工具Cytoscape软件进行.STRING数据库(http://string.embl.de)是一个搜寻已知蛋白质之间和预测蛋白质之间相互作用的系统,它不仅包括蛋白质与蛋白质之间直接的物理的相互作用,而且包括蛋白质与蛋白质之间间接功能的相关性。Cytoscape作为一个开源性网络分析和可视化数据分析软件,目前它可以将生物分子交互网络与高通量基因表达数据和其他的分子状态信息整合建构可视化的分子交互作用网络,并且对大规模蛋白质和蛋白质之间相互作用、蛋白质和DNA之间等交互作用的关联性进行分析。5.统计分析方法：使用R3.01统计软件进行芯片数据处理和分析,原始数据通过RMA(robust multiarray average)背景矫正和四分位数法归一化处理后,对数据进行汇总从而获取表达水平数据。最后采用配对样本t检验和倍比法(fold-change,FC)获取差异表达基因,差异基因需同时满足以下条件：①p-value<0.01;②|logFC|>2。Gene Ontology(基因本体论)、KEGG通路分析和蛋白质互作网络分析采用超几何算法和Benjamini-Hochberg法对数据进行矫正。[研究结果]1.基因芯片分析结果：在烧伤后第一天差异基因进行基因功能本体(GO)分析显示,共有259个刺激反应相关差异基因被选出,其中上调基因118个,下调基因141个。通过KEGG通路富集结果显示前10个通路符合阈值要求并被显著富集。主要为包括免疫系统相关通路(toll样受体信号通路；B细胞受体信号通路；T细胞受体信号通路等)；细胞过程中的细胞生长与死亡相关通路(p53信号通路；细胞凋亡通路)：环境信息进程中的信号转导相关通路。其中差异基因富集最多、最显著的为toll样受体信号通路。2.刺激反应相关蛋白互作网络分析：在刺激反应相关蛋白互作网络图中共由226个节点,1232条边组成,在蛋白互作网络中位于中心位置并且与其他蛋白或基因具有最大互作关系的蛋白或者基因在生物学过程中具有更重要的意义。在蛋白互作网络图中我们发现Jun(Stress=67)、Stat1(Stress=67)、Bcl2 (Stress=56)、Stat3 (Stress=54)、Tlr2(Stress=47)、Myd88(Stress=45)、Jak2 (Stress=41)、Lck(Stress=40)、Hck (Stress=38)、Ptpn6(Stress=38) 10个基因位于网络中心,具有最高互作关系。为了筛选出与刺激反应过程相关的重要的节点基因,我们通过MCL分析方法对原始蛋白互作网络进行聚类分析,选取力度系数大于4.0,互作关系大于6的网络模块进行下一步分析。我们发现MCL分析总共有7个子网络被选出。最后通过蛋白互作网络分析显示：Lck(表达下调)、Stat1(表达下调)、Myd88(表达上调)、Stat3(表达上调)和Jun(表达上调)5个基因不仅在原始网络中具有最大互作关系,而且在MCL网络模块中处于中心位置。[研究结论]通过对小鼠烧伤后一天全血游离白细胞基因芯片分析我们发现Lck、Stat1、 Myd88、Stat3和Jun基因在烧伤早期应对刺激反应过程中可能发挥重要的作用,是潜在的生物靶标。第二部分运用荧光定量PCR技术验证靶标基因[研究目的]通过动物学实验来验证小鼠烧伤后刺激反应相关重要靶标基因。[研究方法]动物分组及烫伤模型建立：选取50只健康成年BALB/c小鼠,体重22-24g,雌雄不限,由南方医科大学动物实验中心提供,并清洁级饲养。分组：假烧伤(Sham)组10只,实验组40只,实验组按烫伤后时间分为烫伤后2h、6h、12h和24h组。模型建立：小鼠用1%的戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔麻醉后,将小鼠背部备皮,尽量不伤及皮肤,硫化钠去尽背部毛发,背部脱毛区域大小4*4cm(约25%TBSA),将小鼠固定于操作板上。将小鼠背部脱毛区域置于97℃热水中烫伤15秒(导致25%Ⅲ度烫伤创面),烫伤后立即腹腔注射0.9%无菌生理盐水1ml抗休克处理,创面使用碘伏消毒后,再无菌纱布包扎。根据时间点行眼部取血,并提取血液中的白细胞,最后用Real-time qPCR法检测小鼠烧伤后白细胞中Lck、Stat1、Myd88、Stat3和Jun mRNA的表达情况。[研究结果]1.以MM-GAPDH为内参,我们使用荧光定量PCR技术检测了小鼠烫伤后2h、6h、12h、24h白细胞中Lck mRNA的相对表达量。以sham组为对照,小鼠烫伤后2h、6h、12h、24h白细胞中Lck mRNA相对表达量(x±s)如下：0.817±0.108、0.644±0.186、0.369±±0.120、0.536±0.131,各组与对照组相比较,组间差异均有统计学意义(P<0.05)。根据数据显示,小鼠烫伤后Lck mRNA的表达量在12h处于较低水平,在烫伤后24h内整体表达下降趋势。2.以MM-GAPDH为内参,我们使用荧光定量PCR技术检测了小鼠烫伤后2h、6h、12h、24h白细胞中Stat-1 mRNA的相对表达量。以sham组为对照,小鼠烫伤后2h、6h、12h、24h白细胞中Stat-1 mRNA相对表达量(x±s)如下：0.780±±0.127、0.527±±0.136、0.338±0.157、0.219±0.110,各组与对照组相比较,组间差异均有统计学意义(P<0.05)。根据数据显示,小鼠烫伤后Stat-1 mRNA的表达量在24h处于最低水平,在烫伤后24h内整体表达持续下降趋势。3.以MM-GAPDH为内参,我们使用荧光定量PCR技术检测了小鼠烫伤后2h、6h、12h、24h白细胞中Myd88 mRNA的相对表达量。以sham组为对照,小鼠烫伤后2h、6h、12h、24h白细胞中Myd88 mRNA相对表达量(x±s)如下：1.498±0.114、1.399±0.082、1.433±0.160、1.434±0.200,各组与对照组相比较,组间差异均有统计学意义(P<0.05)。根据数据显示,小鼠烫伤后Myd88 mRNA的表达量在2h表达量明显增加,在烫伤后24h内表现出持续高表达。4.以MM-GAPDH为内参,我们使用荧光定量PCR技术检测了小鼠烫伤后2h、6h、12h、24h白细胞中Stat-3 mRNA的相对表达量。以sham组为对照,小鼠烫伤后2h、6h、12h、24h白细胞中Stat-3 mRNA相对表达量(x±s)如下：1.424±0.107、1.529±0.094、1.396±0.080、1.680+0.129,各组与对照组相比较,组间差异均有统计学意义(P<0.05)。根据数据显示,小鼠烫伤后Stat-3 mRNA的表达量在12h处于较高水平,在烫伤后24h内整体表达上调。5.以MM-GAPDH为内参,我们使用荧光定量PCR技术检测了小鼠烫伤后2h、6h、12h、24h白细胞中Jun mRNA的相对表达量。以sham组为对照,小鼠烫伤后2h、6h、12h、24h白细胞中Jun mRNA相对表达量(x±s)如下：1.197±0.061、1.535+0.129、1.748±0.079、1.571±0.120,各组与对照组相比较,组间差异均有统计学意义(P<0.05)。根据数据显示,小鼠烫伤后Jun mRNA的表达量在24h处于最高水平,在烫伤后24h内整体表达上调。l研究结论]通过动物实验发现小鼠白细胞中Lck、Stat1、Myd88、Stat3和Jun mRNA表达情况与基因芯片数据分析结果相一致,这进一步证实了这些差异表达基因在应对烧伤刺激反应过程中发挥了重要作用。